Auswirkung des konservativen Aminosäurenaustauschs Lysin gegen Arginin in den Nukleotidbindungsfalten des Sulfonylharnstoffrezeptors SUR2B auf die Bindungseigenschaften

Abstract

Die ATP-sensitiven K+-Kanälen sind aus zwei Untereinheiten der a- (Kir6.1 und Kir6.2) und der b-Untereinheit (Sulfonylharnstoffrezeptor (SUR1 / SUR2)) aufgebaut. Je vier SUR, die regulatorische Untereinheit und vier Kir6.x, die porenbildende Untereinheit, schließen sich zu Heterooktameren zusammen und bilden den Ionenkanal. Die Zusammensetzung der einzelnen KATP-Kanäle ist in den verschiedenen Geweben sehr unterschiedlich (z.B. Kir6.2 / SUR1 in den b-Zellen des Pankreas; Kir6.2 / SUR2A im Myokard; Kir6.2 / SUR2B im glatten, nicht-vaskulären Muskel, Kir6.1 / SUR2B in der glatten Gefäßmuskulatur). Sie sind dafür zuständig die elektrische Zellaktivität an den metabolischen Zustand der Zelle anzupassen, indem sie den K+-Strom regulieren.

Sulfonylharnstoffe (SU) und KATP-Kanal-Öffner (KCO) können an der b-Untereinheit binden und die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals beeinflussen. Darüber hinaus liegt am SUR eine Nukleotidbindungsfalte (NBF) vor, an der MgATP binden kann und dort hydrolysiert wird, was die Bindung der SU und KCO beeinflusst.

In der vorliegenden Arbeit wollte man durch einen konservativen Aminosäureaustausch (Arginin gegen Lysin) herausfinden, ob die NBF sich genau an dieser Stelle befindet, und welche Auswirkung die MgATP-Bindung und Hydrolyse auf die Bindung von GBC und P1075 hat.

Mittels Radioligandbindungsstudien mit dem Radioliganden 3H-GBC wurden Verdrängungs- (mit GBC) und Hemmkurven (mit P1075) erstellt, die über die Affinität und deren Veränderungen durch die KRKR-Mutation Aufschluss gaben. Bei der Verdrängung von 3H-GBC durch GBC wurden die Erwartungen bestätigt, da in der Abwesenheit von MgATP die Bindungskurven miteinander übereinstimmen, auch bei der Versuchreihe in der Anwesenheit von MgATP kam es zu keinem signifikanten Unterschied in der Affinität. Man geht davon aus, dass die starke Hemmung der 3H-GBC-Bindung durch einen Verlust von Bindungsstellen zu erklären ist, da bei den Verdrängungsversuchen von 3H-GBC durch MgATP an der KRKR-Mutation ein deutlicher Abfall der Affinität aufgetreten ist und 3H-GBC nur noch zu einem sehr kleinen Teil verdrängt werden kann.

Bei den KCOs wurde erstaunlicher Weise festgestellt, dass die KRKR-Mutation sogar eine Wirkung auf die Bindung von P1075 hat, wenn kein MgATP im Versuchsansatz vorhanden ist. Es scheint so, als ob die P1075 Bindung durch die Mutation auch stark eingeschränkt ist. Über die Ursachen lässt sich nur spekulieren. Wahrscheinlich kommt es durch die Mutation zu einer Konformationsänderung des gesamten Moleküls, das die Bindung von P1075 erschwert und oder die 3H-GBC-Bindung erleichtert.

Durch diese Studie konnte belegt werden, dass sich die Aminosäure Lysin in der NBF befindet und einen wichtigen Part in der MgATP-Bindung und eventuell sogar in der Hydrolyse desselbigen übernimmt, da die Hemmkurve durch MgATP eigentlich nicht zustande kommt.

The ATP-sensitive K+ channels are built of two subunits; the a- ( Kir6.1 and Kir6.2) and the b-subunit (sulphonylureareceptor (SUR1 / SUR2)). Four SUR, the regulatory subunit, and four Kir6.x, the pore-forming subunit, compose a heterooctamere and form the ion channel. The composition of the KATP-channels in various tissues is very different (e.g. Kir6.2 / SUR1 in the pancreatic b-cells; Kir6.2 / SUR2A in the myocard; Kir6.2 /SUR2B in smooth nonvascular muscle; Kir6.1 / SUR2B in vascular smooth muscle). The KATP-channels link the metabolism of the cell to the mebrane potential, by regulating the K+-current.

Sulphonylureas (SU) and KATP openers (KCO) are able to bind on the b-subunit and affect the probability for opening the channel. The SUR carries nucleotide binding folds (NBF). Where MgATP is binding, it gets hydrolized and affects the SU and KCO binding.

With a conservative amino acid exchange (arginine to lysine) one wanted to find out, if the NBF is really located there, and which kind of effect the MgATP binding and hydrolization has on the GBC and P1075 binding.

By using radio-ligand binding experiments with the radio-ligand 3H-GBC inhibition (P1075) and displacement (GBC) curves were created. These curves gave information about the affinity and the modification by the KRKR mutation. During the displacement of 3H-GBC by GBC the expectation was approved, because in the absence of MgATP the binding curves agreed with each other. Even in the presence of MgATP, there was no significant discrepancy concerning the affinity. It is assumed, that the displacement of the 3H-GBC binding bases on the loss of binding sites. A obvious decrease of affinity occured at the KRKR mutation during the displacement curves with 3H-GBC by MgATP and further more 3H-GBC could only be partly displaced. During the tests with the KCOs it is surprisingly assumed, that the KRKR mutation has an effect on the binding of P1075, when there is no MgATP in the assay. It seems as if the P1075 binding is even severly limited by the mutation. About the reasons one could only speculate. Probably a conformation change of the whole molecule by the mutation complicates the P1075 binding and or facilitate the 3H-GBC binding.

It could be documented by this study, that the amino acid lysine is provided in the NBF and seems to be important for the MgATP binding and possibly even at the hydrolization of MgATP, because the inhibition curve by MgATP falls through.