Immunogenicity of the HO-1 Peptide eluted from Renal Cell Carcinoma for CD8 T cells

Abstract

Studies to identify tumour antigens, test their immunogenicity and develop antigen–specific immunotherapies have made significant progress and entered the mainstream of current immunological research and cancer research over the last decade. So far, the identification of such peptides has been hindered by the presence of only a small number of tumour-specific peptides amongst several thousands of different MHC-peptides on each tumour cell. The identification of human tumour T-cell antigens has to a great extent relied on the use of specific T lymphocytes recognizing the tumour, either based on a gene expression approach or on mass spectrometric sequencing of isolated MHC-peptides. At the time of writing, the public SYFPEITHI database (www.syfpeithi.de) lists about 200 identified human MHC-class I peptides, classified as “cancer-related”.

Heme oxygenase-1 (HO-1) is an inducible stress protein and catalyzes the degradation of heme to carbon monoxide (CO), biliverdin and iron. More importantly, it is now well known that expression of high levels of HO-1 occurs in various tumours, and that HO-1 has an important role in rapid tumour growth because of its antioxidative and antiapoptotic effects. HO-1 was thus considered to be a key molecule for tumours to resist attack by host immunity or treatment by chemotherapy and radiotherapy by protecting the tumour cells from oxidative insults. All these effects taken together suggest a potential association of HO-1 with cancer. Recently, two dominant peptides of monoisotopic masses ((M+H)+) 973.43 u and 967.59 u were found to be present exclusively in the tumour sample from a patient with renal cell carcinoma. One of them was identified as originating from HO-1 and the sequence of this peptide was determined to be APLLRWVL.

The purpose of the present study was to test the immunogenicity of the isolated HO-1 derived peptide and to attempt to generate a specific T-cell population that could recognize HO-1-derived epitopes.

To accomplish this goal the following tasks were set at the beginning of the investigation and have been successfully achieved:

1. To generate specific T-cell lines from PBMC of healthy donors, using synthetic HO-1 peptide.

2. To screen the established T-cell lines for HO-1-specific cytokine release.

3. To measure antigen-specific IFN-gamma production by T lymphocytes at the single cell level.

4. To evaluate the antigen-specific cytolytic activity of the generated peptide-specific CTL line.

The results obtained in this study with the synthetic HO-1 peptide (APLLRWVL) indicate that this peptide is immunogenic in the context of HLA-B*08 and gives rise to peptide-specific T cells. Using a supplementation of priming cultures with cytokines (GM-CSF and IL-4) known to be important growth and differentiation factors for DCs allowed successful generation of HO-1-specific T-cell lines from HLA-matched healthy donors. The T cells obtained under such cytokine-modified priming conditions (121, 122) showed high-level cytokine release on re-challenge with synthetic HO-1 peptide. In addition, using autologous DC in T-cell sensitization experiment, higher proportion of HO-1-specific CTLs was generated. It could be speculated that the HO-1-derived peptide APLLRWVL may be used for in vitro generation of CTLs, which may be considered as a potential adoptive cell therapy for tumours expressing the HO-1 peptide.

Studien, die Tumor-Antigene identifizieren, ihre Immunogenität testen und antigenspezifische Immuntherapien entwickeln, machten grosse Fortschritte und schufen die Grundlage für die gegenwärtige Immunologie- und Krebsforschung in dem letzten Jahrzehnt. Bis jetzt wurde die Identifikation solcher Peptide von der Präsenz nur geringer Anzahl an tumor-spezifischen Peptiden, unter einigen Tausenden unterschiedlichen MHC-Peptiden auf jeder einzelnen Tumorzelle, verhindert. Die Identifikation menschlicher Tumor T- Zellantigene beruht zum grössten Teil auf der Anwendung spezifischer T-Lymphozyten, welche die Tumorzellen erkennen. Dies kann entweder durch die Vorgehensweise der Genexpression oder durch massenspektrometrische Sequenzierung von isolierten MHC-Peptiden erfolgen. Zur Zeit der Forschungsarbeit hat die öffentliche SYFPEITHI Datenbank (www.syfpeithi.de) ungefähr 200 unidentifizierte menschliche MHC-Klasse-I-Peptide aufgelistet und klassifiziert als „krebsbezogen“.

Hemeoxygenase-1 (HO-1) ist ein induzierbares Stressprotein, welches Häm zu Eisen, Biliverdin und Kohlenstoffmonoxid abbaut. Wichtiger ist, dass hohe Niveaus von HO-1 in unterschiedlichen Tumoren zu finden sind, sowie das HO-1 aufgrund dessen antioxidativen und antiapoptotischen Effekt eine ausschlaggebende Rolle für das schnelle Tumorwachstum hat. HO-1 ist ein Tumorenschlüsselmolekül, weil es sowohl den Angriffen des eigenen Immunsystems, als auch chemo- oder radiotherapeutische Behandlung durch eine Protektion der Tumorzellen vor oxidativem Insult widersteht. Kürzlich wurden zwei dominante Peptide von monoisotopischen Massen ((M+H)+) 973.43 u und 967.59 u ausschliesslich nur in Tumorbiopsie von Patienten mit Nierenzellkarzinom gefunden. Eines von den Peptiden wurde als vom HO-1 abstammend identifiziert und seine Sequenz wurde als APLLRWVL determiniert.

Ziel der vorliegenden Studie war das Testen der Immunogenität des aus dem vom HO-1 stammenden isolierten Peptides sowie der Versuch, eine spezifische T- Zellpopulation zu generieren, die der HO-1 entstammten Epitopen erkennen kann.

Um dieses Ziel zu erreichen wurden am Anfang der Forschung folgende Aufgaben gesetzt, die erfolgreich erfüllt wurden. 1. Eine spezifische T- Zelllinie aus PBMZ von einem gesunden Spender durch Verwendung synthetischer HO-1 Peptide zu generieren.

2. Die Prüfung der HO-1 spezifischen Zytokinfreisetzung der erzeugten T-Zelllinien.

3. Messung der antigenspezifischen IFN-gamma Produktion der T- Lymphozyten auf einem einzelnen Zellniveau.

4. Bewertung der antigenspezifischen zytolitischen Aktivität der generierten peptidspezifischen ZTL-Linie.

Die aus dieser Studie gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass das synthetische HO-1-Peptid (APLLRWVL) in dem Kontext von HLA B*08 immunogen ist und zur Gründung peptid-spezifischer T- Zellen führt. Hinzufügung von Zytokinen (GM-CSF und IL-4) zu den angesetzten Kulturen, die wichtige Wachstums- und Differenzierungsfaktoren für dendritische Zellen darstellen, erlaubt die erfolgreiche Erzeugung von HO-1 spezifischen T-Zelllinien aus HLA-kompatiblen gesunden Spendern. Die unter solchen zytokinmodifizierten Ansetzungsbedingungen erzeugten T Zellen, haben ein hohes Niveau an Zytokinfreisetzung auf der Restimulierung mit synthetischem HO-1 Peptid aufgezeigt. Zudem führte die Anwendung von autologen dendritischen Zellen im Rahmen des T- Zellsensibilisierungsexperiments zur Generierung eines erhöhten Anteils an HO-1 spezifischen zytotoksischen T-Lymphozyten. Es kann darüber diskutiert werden, ob das abgeleitete HO-1 Peptid APLLRWVL bei der in vitro Generierung zytotoksischer T-Lymphozyten angewendet werden kann. Dies könnte bei Patienten mit Tumoren, welche HO-1 Peptide exprimieren, als eine potentielle adoptive Zelltherapie berücksichtigt werden.