Role of superoxide dismutase system in the radiation response of tumor cells

Abstract

Es ist bekannt, dass das Superoxid-Dismutase (SOD) System in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zellen, überexprimiert wird. Ionisierende Strahlung (IR) kann die MnSOD- und CuZnSOD-Funktionen induzieren, welche die Tumorzellen vor Strahlungsvergiftung während einer Strahlentherapie schützen. In vorherigen Untersuchungen wurde gezeigt, dass ErbB1 und ErbB2, Rezeptortyrosinkinasen der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren-Familie, in die zelluläre Strahlungsantwort involviert und im Fall von ErbB1 möglicherweise relevant für die Aktivierung der SOD-Aktivität sind. In der vorliegenden Arbeit wurde nun untersucht, in wiefern die ErbB1- und ErbB2-Signalwege auf die SOD-Proteinexpression und -Enzymaktivität Einfluss nehmen.

Die Experimente wurden mit den Lungenkrebs-Zelllinien A549, H460 und H661 durchgeführt. Die strahlungsinduzierte SOD-Aktivität wurde mit einem standardisiertem Superoxid-Dismutase Aktivitätsassay analysiert. Mit Westernblotting wurde das SOD-Expressionsmuster und die Aktivierung von AKT und DNA-PKcs untersucht. Colony Formation Assay und GammaH2AX Foci Assay wurden benutzt, um die zelluläre Strahlungsempfindlichkeit und die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DNA-dsb) zu messen. Um die SOD-Expression herunterzuregulieren wurde small interfering RNA (siRNA) eingesetzt.

Es konnte gezeigt werden, dass klinisch relevante Bestrahlungsdosen sowohl die Enzymaktivität als auch die Proteinexpression dosisabhänig stimulieren können. Analysen mit unterschiedlichen Zielstrategien (siRNA und Inhibitoren) zeigten, dass CuZnSOD als Antwort auf Bestrahlung primär durch ErbB2- und nicht ErbB1-vermittelte, nachgeschaltete Signalwege reguliert wird. Es wurde demonstriert, dass die strahlungsinduzierte SOD-Aktivität klar abhängig von der PI3K/AKT-Aktivität ist. Um die Effekte der SOD-Expression auf das Überleben nach Bestrahlung zu untersuchen, wurde ein früher beschriebener SOD-Inhibitor, 2-ME, benutzt. Eine Kombination von 2-ME mit Bestrahlungsdosen von 1-5 Gy verbesserte die Strahlenempfindlichkeit. Jedoch ist der Effekt von 2-ME auf die Strahlungsempfindlichkeit unabhängig von der Inhibition der SOD-Enzymaktivität, sondern abhängig von einer deutlichen Verringerung der strahlungsinduzierten AKT/DNA-PKcs-Aktivität vermittelt durch 2-ME.

Die vorliegenden Daten zeigen zum ersten Mal, dass die Expression von CuZnSOD, induziert durch ionisierende Strahlung, vom strahlungsinduzierten ErbB2-Signalweg abhängt. Ferner führt das Targeting von SOD mit siRNA nicht zu einer Strahlenempfindlichkeit der untersuchten Tumorzellen. Im Gegensatz zum theoretisch erwarteten Ergebnis, d.h. dass 2-ME die SOD-Enzymfuntion blockiert, konnte gezeigt werden, dass 2-ME eine Strahlensensitivität von Tumorzellen durch Blockade des PI3K/AKT/DNA-PKcs-Signalwegs induziert.

Superoxide dismutase (SOD) system is known to be overexpressed in tumor cells as compared to normal cells. Exposure to ionizing radiation (IR) is able to induce MnSOD and CuZnSOD function which as a consequence may protect tumor cells against radiation toxicity during radiotherapy. Previously it has been shown that receptor tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family members ErbB1 and ErbB2 are involved in cellular radiation responses and in case of ErbB1 also potentially relevant for the activation of SOD activity. In the present study the interaction of ErbB1 and ErbB2 signaling and SOD protein expression and enzyme activity was investigated.

Experiments were performed by using the lung carcinoma cell lines A549, H460 and H661. Radiation-induced SOD activity was analyzed by a standardized superoxide dismutase activity assay. Applying Western blotting, the pattern of SOD expression and activation of AKT as well as DNA-PKcs was analyzed. Colony formation assay and GammaH2AX foci assay were applied to measure cellular radiosensitization and repair of DNA-double strand break (DNA-dsb). To downregulate SOD expression small interfering RNA (siRNA) was used.

It could be shown that clinically relevant doses of irradiation stimulate both enzyme activity and protein expression in a dose dependent manner. Differential analyses applying targeting strategies (siRNA and inhibitors) indicated that CuZnSOD is primarily regulated in response to radiation exposure by ErbB2 and not ErbB1 mediated downstream signaling. IR induced SOD activity was demonstrated to be clearly dependent on PI3K/AKT activity. To investigate the effect of SOD expression on post irradiation survival a previously described SOD inhibitor, 2-ME was used. Combination of 2-ME with radiation doses of 1-5 Gy enhanced radiation sensitivity, however, the radiosensitizing effect of 2-ME could be demonstrated to be independent of inhibition of SOD enzyme activity but dependent on a marked impairment of IR-induced AKT/DNA-PKcs activity mediated by 2-ME.

The data presented indicate for the first time that the expression of CuZnSOD induced by ionizing radiation depends on radiation-stimulated ErbB2-signaling. Moreover, targeting of SOD by siRNA does not lead to radiosensitization of tumor cells. In contrast to the theoretically expected result, treatment with 2-ME which inhibits SOD enzyme activity radiosensitizes cells rather through inhibition of PI3K-AKT-DNA-PKcs signaling than through blockage of SOD enzyme function.