Der Einfluss von Thiopental und Midazolam auf die Differenzierung von Monozyten zu Dendritischen Zellen

Abstract

Einleitung: Dendritische Zellen (DZ) zählen zu den wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen des menschlichen Organismus und spielen eine zentrale Rolle bei der Induktion und Regulation von Immunität. Sie stimulieren hocheffektiv naive CD8 und CD4 T-Zellen sowie B-Lymphozyten zur Immunantwort. Damit sind DZ ein wesentliches Bindeglied zwischen Antigenerkennung und –eliminierung. Midazolam spielt eine wichtige Rolle in der intensivmedizinischen Therapie zur Sedierung Schädel-Hirn-traumatisierter Patienten. In Einzelfällen werden bei therapierefraktär erhöhtem Hirndruck Barbiturate zur Langzeit-Sedierung eingesetzt. Klinische Studien weisen darauf hin, dass die Langzeitsedierung mit Thiopental das Risiko für nosokomiale Infektionen erhöht. Dies wird durch zahlreiche Studien in vitro bestätigt, die inhibitorische Funktionen der Barbiturate, v.a. auf granulozytäre und lymphozytäre Funktionen dokumentieren. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Thiopental und Midazolam auf die Differenzierung, Morphologie und Funktion von DZ untersucht.

Material und Methoden: Für die Gewinnung von DZ wurden Monozyten aus Buffycoats freiwilliger gesunder Spender isoliert und über 8 Tage unter Zusatz von GM-CSF und IL-4 kultiviert. Die DZ wurden mit Thiopental (0 - 0,05 - 0,5 - 5 - 50 - 100 - 250 µg/ml) und Midazolam (0,05 - 0,5 - 1 - 2,5 - 5 µg/ml ) in klinisch relevanten Konzentrationen inkubiert. DZ wurden auf die Oberflächenexpression von CD 1a, CD 40, CD 80, CD 86 und HLA-DR untersucht. Die Phagozytoseaktivität der DZ wurde durch FITC-Dextran-Phagozytose mittels durchflusszytometrischem Verfahren quantifiziert. Die lichtmikroskopische Beurteilung der DZ erfolgte bei 100facher Vergrößerung an Tag 0 und 8.

Ergebnisse: Unter Zusatz von Thiopental zeigten sich Unterschiede in der Differenzierung und Morphologie der Zellen. Signifikante Veränderungen in der Oberflächenmarker-Expression und Phagozytoseleistung der Zellen waren erkennbar. Unter Thiopental kam es dosisabhänging zur signifikanten Inhibition der Expression von CD 40 (88,7%, +/-26,4%, p<0.05), während sich für CD 86 eine signifikante Zunahme der Expression zeigte (85,2%, +/-35,9%, p<0.01). Des Weiteren fand sich dosisabhängig eine verminderte Phagozytoseaktivität für unter Thiopental maturierte DZ (bei 60Minuten 83,0%, +/-30,5%, p<0.01, bei 120 Minuten, 84,4%, +/- 14,3%, p<0.05). Bei hohen Thiopentalkonzentrationen fehlten alle typischen morphologischen Charakteristika von DZ. Unter dem Einfluss von Midazolam ließ sich keine Beeinträchtigung der untersuchten Merkmale Morphologie, Oberflächenmarkerexpression und Phagozytoseaktivität nachweisen.

Zusammenfassung: Unsere Ergebnisse zeigen, dass Thiopental dosisabhängig zu morphologischen, phänotypischen und funktionellen Veränderungen Dentritischer Zellen führt. Dem gegenüber waren unter Midazolam keine Veränderungen der untersuchten Parameter zu erkennen. Die Veränderungen deuten auf eine verminderte Fähigkeit zur Antigenpräsentation hin und dienen als weiteres Erklärungsmodell für die eingeschränkte Infektabwehr kritisch kranker Patienten unter länger andauernder Thiopentalsedierung. Die inhibitorischen Konzentrationen lagen allerdings weit über klinisch üblichen Plasmakonzentrationen von 10-20µg/ml sodass eine direkte Schlussfolgerung bezüglich der immunsuppressiven Wirkung von Thiopental nicht gezogen werden kann.

Introduction: Dendritic cells (DC) belong to the most important antigen presenting cells of the human organism and play a central role in the induction and regulation of immunity. They very effectively stimulate naive CD8 and CD4 T cells and B lymphocytes to immune response. For this reason DC are an essential link between antigen-detection and elimination. Midazolam plays an important role in intensive care medicine for the sedation of brain injured patients. In individual cases, of refractory increased intracranial pressure, barbiturates are used for long-term sedation. Clinical studies suggest that long-term sedation with thiopental increases the risk of nosocomial infections. This is confirmed by numerous studies in vitro, which document the inhibitory functions of barbiturates, especially on granulocytic and lymphocytic functions. In this paper we studied the influence of different concentrations of thiopental and midazolam on the differentiation, morphology and function of DC.

Materials and methods: For the generation of DC monocytes were isolated from buffy coats of healthy volunteer donors and cultured for 8 days with addition of GM-CSF and IL-4. The DC were incubated with thiopental (0 - 0.05 - 0.5 - 5 - 50 - 100 - 250 µg / ml) and midazolam (0.05 - 0.5 - 1 - 2.5 - 5 µg / ml) in clinically relevant concentrations. DC were analyzed for the surface expression of CD 1 a, CD 40, CD 80, CD 86 and HLA-DR. The activity of phagocytosis of DC was quantified by FITC-dextran phagocytosis using flow cytometry methods. The light microscopic evaluation of the DC was carried out at 100fold magnification on days 0 and 8.

Results: With the addition of thiopental, differences in the differentiation and morphology of the cells were shown. Significant changes in surface marker expression and phagocytosis of cells were visible. Under the influence of thiopental, dose-depending, a significant inhibition of the expression of CD 40 could be seen (88.7% + / -26.4%, p <0.05), while for CD 86, a significant increase in the expression was shown ( 85.2%, + / -35.9%, p <0.01). In addition, there was a dose-dependent decrease in thiopental graduated activity of phagocytosis for DC (at 60Minuten 83.0%, + / -30.5%, p <0.01, at 120 minutes, 84.4%, + / - 14.3% p <0.05). At high concentrations of thiopental DC lacked all the typical morphological characteristics. Under the influence of midazolam no impairment of the investigated traits morphology, surface marker expression and activity of phagocytosis could be seen.

Summary: Our results suggest that thiopental leads dose-dependent to morphological, phenotypic and functional changes in dendritic cells. In contrast, under the influence of midazolam no changes in these parameters could be seen. The changes indicate a decreased ability for antigen presentation and serve another explanation for the limited infection defense of critically ill patients on prolonged sedation with thiopental. However, the inhibitory concentrations, were far above clinically normal plasma concentrations of 10-20 myg/ml so that a direct conclusion on the immunosuppressive effect of thiopental cannot be drawn.