Vergleichende Untersuchung zweier rekombinanter humaner Bone Sialoproteine auf humane Osteoblasten und Stromazellen, sowie Osteoblasten und Knochenmarkzellen des Schweins

Abstract

Im Zuge der Fragestellung, ob rekombinantes Bone Sialoprotein sowohl auf Gen- als auch mitochondrialer und histochemischer Ebene die Expression und Proliferationsraten, als auch die Sekretion typischer Osteoblasten Marker be-einflusst, kamen in unseren Untersuchungen zwei unterschiedlich hergestellte BSP-Proteine der Firma Immunodiagnostik zum Einsatz. Da BSP eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Knochenmarkzellen zu Osteoblasten spielt und stimulierende Effekte beobachtet werden konnten, wurden in dieser Arbeit sowohl humane Osteoblasten und Stromazellen, als auch Knochenmarkzellen und daraus differenzierte Osteoblasten von jungen Schweinen untersucht. Mittels RT-PCR Untersuchungen an humanen Osteoblasten und Stromazellen konnten wir zeigen, dass bei einer Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen der zwei untersuchten rekombinanten Bone Sialoproteine, die Gene Osteopontin, Osteonectin und TGF-ß weder induziert, noch gehemmt werden. Hoch signifikante Ergebnisse einer Hemmung der mitochondrialen Aktivität konnten im MTT-Assay nach 48, 72 und 96h, nicht jedoch nach 24h-Inkubation für BSP an humanen Osteoblasten und Stromazellen erzielt werden. Das DRJ Protein zeigte bereits nach 24h-Inkubation hoch signifikante Ergebnisse einer Hemmung. In Vorversuchen konnte an humanen Osteoblasten mehrerer Patienten bei niedrigen BSP-Konzentrationen und verschiedenen Zellkonzen-trationen mittels BrdU-Assay nach 24h-Inkubationszeit eine signifikante Hemmung der Proliferation auf DNA-Ebene gezeigt werden. Diese Ergebnisse ließen sich jedoch in den Hauptversuchen, bei dem Einsatz weit umfassender Proteinkonzentrationen und der Mittelung der Messwerte humaner Zelllinien, weder für BSP, noch für DRJ bestätigen. In den Histochemischen Unter-suchungen konnten die typischen Osteoblastenmarker, wie das Enzym Alkalische Phosphatase (AP) und mittels der von Kossa-Färbung, die Osteokalzin Sekretion, in humanen Osteoblasten und Stromazellen, sowie auch in differenzierten Osteoblasten vom Schwein nachgewiesen werden, BSP vermittelte Effekte waren jedoch nicht erkennbar.

In this work we explored the different effects of two different recombinant human bone sialoproteins (bsps), both produced by the company Immunodiagnostik, on human osteoblasts and bone marrow cells from pigs. We were able to show that incubation of these cells with different concentrations of Bone Sialoprotein does not lead to a significant induction in Osteopontin, Osteonectin and TGF-ß expressions. However, significant results were obtained when we explored the effect of Bone Sialoprotein on the mitochondrial activity of human osteoblasts, which was significantly reduced after 48h, 72h and 96h of incubation with bsp. Differential effects were seen for the two bsps after 24h of incubation. By employing a brdu assay a significant decrease in cell proliferation was observed after 24h of incubation with low concentrations of Bone Sialoprotein.