Denervation und Reinnervation in humanen Muskelbiopsien mit neurogener Atrophie

Abstract

Denervation von Muskulatur führt zu neurogener Atrophie. Diese geht mit morphologischen Veränderungen, wie dem Auftreten von angulär-atrophen Fasern, einher und führt zur Expression von Denervationsmarkern, wie NCAM, MHCn, Myogenin und Tenascin. In humanen Muskelbiopsien liegt ein heterogenes Muster an Fasern vor. Im Gegensatz zur Denervation im Tierexperiment kann nicht direkt auf den Innervationzustand geschlossen werden. Stattdessen liegen in humanen Muskelbiopsien mit neurogener Atrophie denervierte, reinnervierte und normale Fasern nebeneinander vor. In der Literatur wurden zwar sowohl morphologische Veränderungen beschrieben, die auf Denervation einer Faser hinweisen, als auch einige Denervationsmarker, die nach Denervation aufreguliert werden. Doch wurden bisher weder mehrere Denervationsmarker im Zusammenhang noch der Zusammenhang zwischen der Expression von Denervationsmarkern und dem Vorliegen von morphologischen Veränderungen, wie Atrophie untersucht, so dass es momentan noch nicht möglich ist, genaue Aussagen über den Innervationszustand von Muskelfasern in humanen Muskelbiopsien zu treffen. Ziel dieser Arbeit war es daher, durch vergleichende Untersuchung mehrerer Denervationsmarker (NCAM, MHCn, Myogenin und Tenascin) und durch Vergleich der Expression dieser Marker in Fasern mit verschiedenem Ausmaß an Atrophie eine genauere Aussage über Denervation und Reinnervation in einer humanen Muskelbiopsie zu treffen, als dies anhand der bisherigen Erkenntnisse möglich war. Es wurden dabei 66 humane Muskelbiopsien mit neurogener Atrophie immunhistochemisch auf ihre Reaktivität mit Anti-NCAM, Anti-MHCn, Anti-Myogenin und Anti-Tenascin überprüft. Um speziell die Expression dieser Marker nach Denervation zu untersuchen, wurden Biopsien die für Vimentin, einem regenerationsspezifischen Marker, positiv waren, ausgeschlossen. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zur Morphologie der Fasern wurden die Muskelfasern in die Kategorien „normal groß“, „angulär-atroph“ und „klein“ eingeteilt. Die Menge der positiven Fasern wurde getrennt für diese drei Kategorien ermittelt. Überraschend war das Vorliegen einer großen Menge an kleinen Fasern, was für humane Muskelbiopsien so bisher nie beschrieben worden war. Diese kleinen Muskelfasern sind signifikant häufiger MHCn-positiv als NCAM- oder Myogenin-positiv (p<0,0001). Entstanden sind diese Muskelfasern vermutlich im Rahmen von durch Denervation ausgelösten Myogenesevorgängen mittels Aktivierung und Fusion von Satellitenzellen. Myogenese spielt demnach in denervierter humaner Muskulatur eine weitaus größere Rolle als bisher angenommen. Angulär-atrophe Fasern waren insgesamt ähnlich häufig für NCAM und MHCn positiv (p=0,28). Erstaunlicherweise unterschied sich die Menge der NCAM- und MHCn-positiven Fasern in den einzelnen Biopsien jedoch häufig. Dies deutet darauf hin, dass NCAM und MHCn zeitlich nicht exakt dem gleichen Expressionsmuster folgen. Einige angulär-atrophe Fasern sind MHCn-positiv, jedoch NCAM-negativ. Dies liegt vermutlich daran, dass die Expresssion von NCAM, wie in der Literatur beschrieben, nach Reinnervation sehr rasch zurückgeht. Normal große Fasern waren häufiger NCAM-positiv als MHCn- oder Myogenin-positiv. Dies entspricht den Erwartungen, da NCAM auch im Tierexperiment früher als MHCn oder Myogenin exprimiert wird. Auffällig war jedoch das Vorliegen von erstaunlich vielen NCAM- und MHCn-negativen angulär-atrophen Fasern. Dies kann nur durch Reinnervation erklärt werden. Reinnervation liegt demnach in humanen Muskelbiopsien mit neurogener Atrophie überraschend häufig vor. Myogenin-positive Fasern waren erstaunlicherweise nur in wenigen Biopsien zu finden. Wenn Myogenin-positive Fasern vorlagen, dann handelte es sich vor allem um angulär-atrophe und kleine Fasern. Ebenfalls erstaunlich war das Expressionsmuster von Tenascin: Tenascin unterschied sich von den anderen Denervationsmarkern dahingehend, dass es eher Felder von positiven Fasern bildete, anstatt einzelne Fasern anzufärben und von allen Faserformen ähnlich häufig exprimiert wurde. Tenascin korreliert dabei eher mit dem Ausmaß an Atrophie insgesamt ohne speziell von denervierten Fasern exprimiert zu werden und kann daher nicht als spezifischer Denervationsmarker angesehen werden. NCAM und MHCn stellen demnach brauchbare Denervationsmarker dar und lassen bei kombinierter Anwendung gute Schlüsse auf das Vorliegen von Denervation und Reinnervation in humanen Muskelbiopsien zu. Myogenin und Tenascin sind als Denervationsmarker nicht empfehlenswert. Myogenin wird nur von einem geringen Teil der denervierten Fasern exprimiert, während Tenascin überhaupt nicht dem Muster der anderen Denervationsmarker folgt und eher ein Marker für pathologische Veränderungen im Allgemeinen als speziell für Denervation zu sein scheint. Die Bezeichnung als Denervationsmarker ist bei Tenascin daher in Frage zu stellen. Das Vorkommen einer großen Menge an kleinen Fasern zeigt, dass Myogenesevorgänge in humanen Muskelbiopsien mit neurogener Atrophie in überraschend großem Maße ablaufen und erweitert die ohnehin schon hohe Komplexität von neurogener Atrophie um einen weiteren wichtigen Aspekt.

Denervation of muscle tissue leads to neurogenic atrophy characterized by certain morphologic changes like angular-atrophic myofibers and leads to the expression of markers of denervation like Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM), Myosin Heavy Chain neonatal (MHCn), myogenin and tenascin. In contrast to experimentally denervated muscles in animals, human muscle biopsies with neurogenic atrophy consist of myofibers in different states of innervation. A mixture of denervated, reinnervated and healthy myofibers can be found in each biopsy. In literature morphologic changes in denervated muscle biopsies as well as markers that are upregulated after denervation have been described. At present, little is known about the co-expression of different markers of denervation or about the co-existence of markers of denervation and morphologic changes what makes it difficult to infer the state of innervation of myofibers in human muscle biopsies. The objective of the present study is to give better evidence about denervation and reinnervation in human muscle biopsies by comparison of different markers of denervation (NCAM, MHCn, myogenin and tenascin) and by comparing their expression with the degree of atrophy of the myofibers. Skeletal muscle biopsies of 66 patients diagnosed with neurogenic atrophy were immunolabeled with anti-NCAM, anti-MHCn, anti-myogenin and anti-tenascin. Immunolabeling with anti-vimentin was performed to exclude regeneration. To compare the expression of markers of denervation with the morphology of the fibers, all myofibers were divided into the categories “normal”, “angular-atrophic” and “small”. The amount of immune-positive fibers was detected for each category. Both anti-NCAM and anti-MHCn studies indicated small myofibers that have not been described in denervated human muscle so far. The percentage of NCAM-positive small myofibers was lower in every biopsy compared with the percentage of MHCn-positive fibers (p<0.0001). These small fibers are most likely the result of myogenesis by activation and fusion of satellite cells. The percentage of MHCn-positive angular atrophic fibers was not significantly different from that of NCAM-positive fibers (p=0.28), but often differed within one biopsy. This indicates a difference in the time of upregulation of the two markers. Some angular-atrophic fibers are MHCn-positive, but NCAM-negative. This can be explained by the rapid downregulation of NCAM following reinnervation. A large number of NCAM- and MHCn-negative angular atrophic fibers could be explained by reinnervation, suggesting a larger degree of reinnervation in human muscle biopsies with neurogenic atrophy than suspected so far. The percentage of MHCn-positive or myogenin-positive morphologically normal myofibers was lower in every biopsy compared with the percentage of NCAM-positive normal myofibers. This can be explained by the earlier expression of NCAM after denervation, known from animal experiments. Myogenin-positive fibers could only be found in a few biopsies, they mainly belonged to the categories “angular-atrophic” or “small”. Tenascin showed a completely different expression: In contrast to the other markers of denervation, it formed areas of positivity instead of being expressed by single denervated fibers and it was expressed by angular-atrophic, small and normal fibers in the same amount. Tenascin seemed to correlate with the degree of atrophy in general without being predominantly expressed by denervated fibers. As a conclusion, tenascin cannot be regarded as a specific marker of denervation. NCAM and MHCn can be regarded as good markers of denervation, allowing conclusions about the existence of denervation and reinnervation within human muscle biopsies, especially if used in combination. Myogenin and tenascin cannot be recommended as markers of denervation. Myogenin is only expressed by a small part of denervated fibers, tenascin shows a completely different pattern of expression than all other markers and seems to be a marker of pathologic changes in general more than of denervation in specifity. The occurance of a large amount of small fibers suggests that myogenesis can frequently be found in human denervated muscles and is likely to play a more important role than so far suspected.