Mutationsanalyse und Haplotypenvergleich in CDCrel-1 und GPR37 bei Patienten mit Morbus Parkinson

Abstract

Für den autosomal-rezessiven juvenilen Parkinsonismus (AR-JP) sind verschiedene Krankheitsgene bekannt. Eines davon ist die E3 Ubiquitin-Ligase Parkin. Neben weiteren Interaktionspartnern sind insbesondere das Septin CDCrel-1 (PNUTL-1) und der G-Protein gekoppelte Transmembranrezeptor Pael-R (GPR-37) von Interesse, da einige Arbeiten Hinweise auf die Akkumulation dieser Proteine im ZNS juveniler Parkinson-Patienten ergeben haben. Ziel dieser Arbeit war eine Mutationsanalyse aller Exone beider Gene, um relevante Mutationen aufzudecken. Hierfür wurde mittels denaturierender Hochdruckflüssigchromatographie (dHPLC) für CDCrel-1 insgesamt 364 Proben und für Pael-R insgesamt 333 Proben von Parkinson-Patienten sowie 264 Proben einer Kontrollgruppe untersucht. Proben mit aufälligem Elutionsprofil wurden anschliessend mittels zyklischer Sequenzierung überprüft. Für CDCrel-1 konnte in Exon 7 in einer der 315 vollständig untersuchten Proben für Exon 2-12 (0,31%) eine stumme Variante nachgewiesen werden. Hierbei handelt es sich um einen Austausch der Base C mit T an Position 6140, sodaß die Translation der Aminosäure Isoleucin unverändert erfolgt (c.6140C>T, p.I182I). Für Pael-R konnte neben zwei bekannten häufigen Polymorphismen (rs724356 und rs3735270) ein weiterer Polymorphismus c.48T>C, p.L16L mit stummer Kodierung von Leucin in 7,5% der Proben ausgemacht werden. Hierbei handelt es sich um einen Austausch der Base Thymidin mit Cytosin an Position 48. In der Kontrollgruppe waren es 4,5%. Da in der dHPLC für unterschiedliche Polymorphismen sich ähnliche Elutionsprofile zeigten, wurde zur genauen Berechnung von Genotypen und Allelfrequenzen für 246 bzw. 262 Patienten mit Parkinson und 275 bzw. 267 „Old-People“-Kontrollen mittels Pyrosequenzierung die entsprechenden Allele für rs724356 und rs373570 bestimmt. Zuvor musste aufgrund des geringen DNA-Materials eine nested-PCR der relevanten Genabschnitte durchgeführt werden. Für rs373570 wurde bei den Parkinsonpatienten das G-Allel in 71% der Fälle nachgewiesen, während in der Kontrollgruppe nur 54% der Proben dieses Allel trugen. Entsprechend wurde eine Homozygotie für das GG-Allel in 51% der Parkinsonfälle bei nur 29% der Kontrollgruppen beobachtet. Die Allelfrequenz des Haplotypes C_G für PAEL-R ist in Parkinson-Fällen somit signifikant erhöht (p>0,0001). Man kann also davon ausgehen, daß das G-Allel ein Marker für einen funktionellen Polymorphismus darstellt, der außerhalb des untersuchten Genabschnittes liegt. Weitere Analysen, unter anderem Mutationsscreening der Promotor-Region auf funktionelle SNPs und durch Expressionsklonierung der Haplotypen auf Unterschiede in Transkriptmenge, Transkriptstabilität oder posttranskriptionalen Modifizierungen sind vielversprechende Ansätze.

Several genes including the E3 ubiquitin ligase Parkin are known to cause autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP). Among others, there is growing evidence that the interaction partners septin CDCrel-1 (PNUTL-1) and the transmembrane receptor Pael-R (GPR-37) might accumulate in the brain of diseased patients. Aim of the current work was mutational analysis of all exons of both genes. Using the dHPLC method 364 samples for CDCrel-1 and 333 samples for Pael-R and 264 controls were screened. Samples with conspicious elution profiles were further analyzed by direct gene sequencing. For CDCrel-1 in exon 7 in one of 315 samples (0.31%) a silent mutation (c.6140C>T, p.I182I) was detected. For Pael-R besides two known polymorphisms (rs724356 and rs3735270) a third polymorphism (c.48T>C, p.L16L) in 7.5% of all parkinson cases was identified, while the polymorphism was present in 4.5% of all controls. Because similiar elution profiles for two different polymorphisms existed, allele frequencies were determined with the pyrosequencing method in 246 resp. 262 patients and in 275 resp. 267 controls. Because of limited DNA availability a nested PCR beforehand was necessary. For rs373570 the G allele was present 71% of parkinson patients and in 54% of the controls. Accordingly homozygosity for the GG allele was seen in 51% of parkinson patients but present in only 29% of controls (differences were significant (p>0,0001). Thus it is possible that the G allele might represent a marker for a functional polymorphism outside of the examined gene region. Further analysis including the promotor region of the PAEL-R gene is warranted.