Adenovirus vermittelte in vitro Suizidgentherapie des humanen Hepatoblastoms mittels Cytosindesaminase/5-Fluorcytosin

Abstract

Hintergrund: Das Hepatoblastom (HB) ist der häufigste Lebertumor im Kindesalter und hat bei den malignen Erkrankungen im Kindesalter einen Anteil von 0,8-1,0%. Die Prognose und das Langzeitüberleben für Kinder mit einem HB im Stadium III oder IV bzw. bei Rezidiven ist aufgrund der sich entwickelnden Chemotherapieresistenz nicht ausreichend zu verbessern. Daher ist es von großer Bedeutung neue Therapiealternativen zu entwickeln und zu untersuchen. In der Therapie solider Tumoren u.a. Ovarial-CA, Colon-CA, Mamma-CA u d HCC, spielt die Gentherapie derzeit eine wichtige Rolle. Aus diesem Grunde wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal in der Therapie des HB eine viral-vermittelte Gentherapie (Suizidgentherapie) untersucht. Material/Methode: Die Suizidgentherapie beruht auf dem Konzept Tumorzellen selektiv durch Erzeugung toxischer Metabolite aus einer nicht toxischen Substanz, sogenanntes Prodrug, wie z.B. 5-Fluorcytosin (5-FC) in die zytotoxische Substanz, hier 5-Fluorouracil (5-FU), umzuwandeln. Das dafür notwendige Enzym wird durch einen viralen Vektor (hier Adenovirus) in die Zelle als sogenanntes Suizidgen transduziert und dort exprimiert. In dieser Arbeit war das Suizidgen ein Fusionsgen aus der Cytosindesaminase aus Saccharomyces cerevisae (YCD = Yeast CD) und der nachgeschalteten Yeast Uracilphosphoribosyltransferase (YUPRT). Dieses Fusionsgen wird Super-Cytosindesaminase (SCD = SuperCD) genannt. Zu Anfang der Untersuchung wurde für alle drei HB-Zelllinien HepT1, HepT3 und HUH6 sowie für die HCC-Zelllinie HepG2 mittels direkter und indirekter Immunfluoreszenz qualitativ die adenovirale Transduktion überprüft für AdGFP (Kontrollvirus) und AdSuperCD. Mittels FACS-Analyse konnte die adenovirale Transduktion quantitativ für alle Zelllinien überprüft werden. Die Expression des Suizidproteins SuperCD konnte im Western Blot für die beiden HB-Zelllinien HepT1 und HepT3 sowie für das HCC HepG2 gezeigt werden, jedoch nicht für die HB-Zelllinie HUH6. Folgend wurden für jede Zelllinie Proliferationsassays unter Behandlung mit aufsteigenden Konzentrationen für 5-FU und 5-FC in Mehrfachbestimmungen durchgeführt und zu zwei späteren Zeitpunkten unabhängig voneinander wiederholt. Der Proliferationsassay diente zur Überprüfung der Funktionalität des Suizidgeneffektes des AdSuperCD. Anhand des Rechenmodells der nicht linearen Regression wurde die IC 50 für 5-FC und 5-FU für die entsprechenden Behandlungsgruppen (Kontrolle, AdGFP, AdSuperCD) berechnet. Ergebnis: Für die Therapie mit 5-FU reagiert die HB-Zelllinie HUH6 bereits bei geringen Konzentrationen von 5-FU mit einer starken Proliferationsabnahme, wohingegen HepT1, HepT3 und HepG2 im Gegensatz erst bei einer 10-15-fachen höheren Konzentration von HUH6 eine Proliferationsabnahme zeigten. Bei HepT1, HepT3 und HepG2 zeigte sich in der Behandlungsgruppe AdSuperCD und Therapie mit 5-FU eine höhere Sensibilität als in der Kontrollgruppe. Die Suizidgentherapie mit Adenovirus SuperCD und dem Prodrug 5-FC zeigte für zwei HB-Zelllinien HepT1und HepT3 und die HCC-Zelllinie HepG2 ein Absterben der mit AdSuperCD transduzierten Zellen unter Behandlung mit dem Prodrug 5-FC, welches intrazellulär durch das exprimierte Suizidprotein zu 5-FU metabolisiert wurde. Die Zelllinie HUH6 sprach aufgrund der ausbleibenden Promotoraktivität des AdSuperCD Virus und der dadurch fehlenden Expression des Suizidproteins nicht auf die Suizidgentherapie an. In einem Promotorassay konnte gezeigt werden, dass der Promotor CMV des AdSuperCD in der Zelllinie HUH6 nicht zur Expression führt. Diskussion/Ausblick: Die Suizidgentherapie mit AdSuperCD bietet eine sehr gute Alternative für die Therapie des HB in vitro. Der Suizidgentherapieeffekt war in den beiden Subtypen embryonal und embryonal-fetal vorhanden und führte zu guten Therapieergebnissen. Das „Nicht-ansprechen“ des Typs „mixed HB“ ist auf die fehlenden CMV Promotoraktivität zurückzuführen. Es ist anzunehmen, dass bei Durchführung der Suizidgentherapie mit einem anderen Promotor die Suizidgentherapie auch hier einen Effekt zeigt, dass dieser Typ in vitro bereits sehr gut auf den Metabolit des 5-FCs, das Zytostatikum 5-FU, anspricht. Für den klinischen Einsatz der Suizidgentherapie sind weitere experimentelle Untersuchungen unter Einschluss des HB-Xenotransplantatsmodelles jedoch essentiell.

Background: Human hepatoblastoma (HB) is the most primary malignant liver tumor in children and infants with a part of 0,8-1,% of all malignancies in childhood. Multidrug resistance is a key factor for the sobering outcome of relapsed and metastatic human hepatoblastoma (HB). Gene directed treatment approaches were recently identified as possible treatment options against advanced HB, in which standard chemotherapy regimens are partially insufficient. This is the first study to systematically analyze the effects of suicide gene therapy in three HB cell lines (HepT1, HepT3,HUH6) and one HCC (HepG2)cell line using a yeast-derived cytosine deaminase (YCD)-combined yeast uracil phosphoribosyltransferase (YUPRT)-based adenovirus-mediated gene transfer. Procedure: Suicide gene therapy has the aim to generate toxic metabolites of a non-toxic substance named pro-drug. In this study we used the prodrug 5-fluorcytosin which was metabolized in the toxic substance 5-fluoruracil by two enzymes. The two enzymes, YCD and YUPRT, were fused to form the bifunctional suicide gene SuperCD. Adenoviral vectors were used for transduction. At first we analyzed for all 4 cell lines by direct an indirect fluroescence microscopy adenoviral transduction for AdGFP (control) and AdSuperCD. The SuperCD Protein was detected by Western Blot analysis. Tumor cells transduced at MOI 50 were incubated with 5-fluorocytosine (5-FC) an with 5-flurouracil in ascending concentrations and a viability assay was used to assess cell viability in treated tumor cells. Results: Transduction rates were 87.8% (+6.7) in the mixed HB cell line HUH6, 98.6% (+1.4) in the epithelial HB cell line HepT1 and 93.6% (+0.6) in the multifocal HB embryonal cell line HepT3, respectively. In HepT3 and HepT1 cells suicide gene therapy with SuperCD/5-FC was highly effective leading to HB cell damage far above those of application of the prodrug 5-FC only. In HUH6 cells the approach had no effect due to a lack in activity of the CMV promoter being employed for transcription of the SuperCD transgene. Conclusion: Assuming employment of fully active promoters, the SuperCD/5-FC approach may serve as a potentially useful anti-tumor strategy against advanced HB.