Die Regulationsdynamik auf Niveau der T-Zell-Signaltransduktion bei Multipler Sklerose als ein möglicher Mechanismus der Entstehung von Autoimmunität

Abstract

In der Immunmodulation der T-Zelle spielen die Moleküle der T-Zell- Signaltransduktion eine zentrale Rolle. Kommt es zu quantitativen oder qualitativen Störungen auf diesem Niveau kann dies die Entstehung von Autoimmunität begünstigen. Diesbezüglich wurden hier mittels rt-PCR-Analysen und interspezifischem Primerdesign die Genexpression von frühen, zentralen Komponenten der T-Zell-Signaltransduktion untersucht. Die mRNAExpressionsniveaus von LAT, Nck, Grb2, Crk und c-Cbl wurden in CD4+ TLymphozyten von Patienten, welche an Multipler Sklerose erkrankten (n=10) waren, mit denen einer gesunden Kontrollgruppe (n=10) vor und nach Stimulation verglichen. Im Vergleich beider Gruppen ergaben sich, mit Ausnahme von c-Cbl, eine durchschnittlich ähnliche basale Genexpression der Signaltransduktionsmoleküle. Im Falle von c-Cbl ließ sich eine auffallend geringere Expression dieses Moleküls in der Gruppe der MS-Patienten beobachten. Nach Stimulation zeigten die vergleichende Genexpressionsanalyse der Signaltransduktionsmoleküle in den PBMCs der MS-Patienten eine geringere Hochbzw. eine Runterregulation, worin sich ein mögliches Stadium der Anergie in den untersuchten Zellpopulationen zwischen den Schüben einer MS ableiten lassen kann. Bei der Untersuchung der Regulationsdynamik im Einzelnen zeigte LAT die stärkste Hochregulation, was die zentrale regulatorische Funktion dieses Adapters in der frühen TCR-Signaltransduktion unterstreicht. Zwei Transfektanten (58 alpha-/beta- T-Lymphomzellen aus der Maus), die einen transgenen humanen TCR aus T-Zellklonen von MS Patienten bekannter Spezifität (MBP80-99 bzw. MBP139-151) exprimieren, ermöglichten weitere stimulationsabhängige Signaltransduktionsanalysen. Diese Modellzellen zeigten eine vergleichbare basale Transkriptionsaktivtät wie humane T-Zell-Lymphom-Zellen (Jurkat-Zellen), wiesen aber eine deutlich erhöhte basale Expression im Vergleich zur humanen Kontrollgruppe oder murinen Splenozyten auf. Auffallende Ähnlichkeit in ihrer verhältnismäßigen Unterexpression von c-Cbl zeigten die Modellzellen mit den PBMCs der MS-Patienten. Bei kinetischer Untersuchung nach antikörpervermittelter Stimulation (anti-CD3 +/- anti-CD28) zeigten sie in der Effektorphase zunächst eine Runterregulation und im weiteren Verlauf bei der Ausbildung einer „Funtional Avidity Maturation“ bzw. einer Gedächtnisfunktion eine deutliche Hochregulation der Signaltransduktionsmoleküle. Die anti-CD28-Stimulation ergab dabei einen additiven Effekt und unterstreicht die Wichtigkeit einer Kostimulaiton in diesem Prozess. Die Stimulation mittels MBP-Präsentation ohne Kostimulation ergab eine dazu gegenläufige Kinetik, nämlich den Versuch ein schwaches Rezeptorsignal mittels Hochregulation zunächst quantitativ zu verstärken, um nach Ausbleiben einer suffizienten immunlogischen Synapse durch die Runterregulation der Signaltransduktionsmoleküle in Anergie zu gehen. Physiologische Aspekte, aber auch modellzellbedingte Besonderheiten konnten gezeigt werden, und die besondere Rolle zweier zukünftig klinisch interessanter Moleküle der T-Zellsignaltransduktion, LAT und c-Cbl, wurden dadurch unterstrichen.

In the immune modulation of T-cells, the molecules of TCR-signalling play a crucial role. Quantitative or qualitative alterations in TCR-signalling influence the generation of autoimmunity. To substantiate this hypothesis in this work we examined the quantitative gene expression of intracellular molecules in early TCR-signalling events by rt-PCR-analysis and an interspecific primer design for human and murine mRNA expression analysis. To obtain a quantitative and dynamic expression profile we analyzed the mRNA-expression of LAT, Nck, Grb2, Crk and c-Cbl in CD4-specific T-lymphocytes of patients with multiple sclerosis (n=10) and a control group of healthy donors (n=10) before and after stimulation in vitro. Quantitative analysis showed a similar basic expression profile of all examined molecules except of c-Cbl. In the case of c-Cbl, a negative regulating protein, the group of multiple sclerosis patients showed a significant lower basic expression. Following stimulation, the mRNA-expression profile of multiple sclerosis patients showed a weaker up-regulation or even a down-regulation of TCR-signal transducing molecules compared to lymphocytes of healthy donors, indicating a state of T-cell anergy in-between two events of demyelinating disease. In case of LAT-regulation, rt-PCR-analysis showed the strongest up-regulation of mRNA, indicating the crucial function of this central adapter molecule in TCR-signal transduction. The rt-PCR-analysis of two model cell lines (murine 58 alpha-/beta- T-lymphocytes tranfected with human TCR of a known specifity, MBP80-99 and MBP139-151 respectively, from cell clones of human multiple sclerosis patients) allowed further investigation of stimulation-dependent regulation of downstream TCR-signal transducing molecules. The model cell lines showed a similar basic expression profile regarding the molecules LAT, Nck, Grb2, and Crk compared to the human Jurkat T-cell lymphoma cell line. Compared to the T-lymphocytes of the human control group or to murine splenocytes, the adapter molecules in lymphocyte signalling in these model cells showed a significant higher basic expression, except the c-Cbl molecule showing a lower basic mRNA expression in the transfected model cells, analogous to the PBMCs of multiple sclerosis patients. In a time dependent mRNA analysis following anti-CD3 and additional anti-CD28 stimulation the adapter molecules showed a down-regulation during the early effector phase and a renewed up-regulation in the further course of time, implicating an effect of functional avidity maturation and memory function. The CD28 co-stimulation gave an additional effect indicating the importance of co-stimulation in this process. The weaker physiological stimulation of model cell lines and human T-lymphocytes using MBP-presenting cells in the in vitro setting showed an anti-cyclic expression pattern: an up-regulation of signalling molecules in early stages showed the intracellular attempts of amplifying a weak receptor signal and strengthen the immunological synapse followed by down-regulation of adapter molecules in absence of a functional immunological synapse leading the T-cell to a state of anergy. In these kinetic mRNA expression profiles of adapter molecules in TCR-signalling, on the one hand physiological aspects and on the other hand a special behavior of model cell-chimera could be shown. Expression profiles following stimulation of human T-lymphocytes demonstrated two outstanding regulatory molecules, LAT and the onco-protein and negative regulator c-Cbl, indicating an interesting role of these molecules for further investigation in multiple sclerosis and autoimmunity.