Role of PI 3-kinase and Serum- and Glucocorticoid-inducible Kinases 1 and 3 in the regulation of mast cell function

Abstract

Mast cells play a central role in IgE-dependent allergic reactions including allergic rhinitis, asthma, anaphylactic shock and delayed hypersensitivity reactions.

The mechanism of mediator secretion from mast cells in disease includes modulation of ion channel activity. Cross-linking of the mast cell IgE-receptor (FceRI) by antigen (Ag) leads to stimulation of Ca2+ entry with subsequent mast cell degranulation and release of inflammatory mediators. Ca2+ further activates Ca2+-activated K+ channels, which in turn provide the electrical driving force for Ca2+ entry. The phosphoinositol-3 (PI 3)-kinase pathway plays a pivotal role in the stimulation of mast cells. Previous studies have shown, that PI3-kinase is required for mast cell activation and degranulation. Kinases activated through the PI 3-kinase pathway include serum- and glucocorticoid-inducible kinases 1 (SGK1) and 3 (SGK3).

The present study has been performed to elucidate whether PI 3-kinase participates in the regulation of mast cell Ca2+ and Ca2+-activated K+ channels, and whether PI 3-kinase-dependent modulation of those channels is involved in the regulation of mast cell function. Also we explored the role of SGK1 and SGK3 in mast cell function. To this aim the whole-cell patch clamp experiments and Fura-2 fluorescence measurements for determination of cytosolic Ca2+ concentration were performed in LY-294002-treated and untreated mouse bone marrow-derived mast cells (BMMCs). In response to FceRI cross-linking, Ca2+ entry but not Ca2+ release from the intracellular stores was dramatically reduced upon inhibition of PI 3-kinase by LY294002. Ca2+ entry following readdition of Ca2+ after Ca2+-store depletion with thapsigargin was also decreased by LY-294002, pointing to inhibition of store-operated channels (SOCs). Moreover, inhibition of PI 3-kinase abrogated IgE-mediated, but not ionomycin-induced stimulation of Ca2+-activated K+ channels.

To explore the role of SGK1 and SGK3, mast cells have been isolated from bone marrow of SGK1 and SGK3 knockout mice (sgk1-/-, sgk3-/-) and their wild-type littermates (sgk1+/+, sgk3+/+). Forward scatter, as determined by FACS analysis, was significantly smaller in sgk1-/- than in sgk1+/+ BMMCs, pointing to a decrease in cell volume. There was no difference in forward scatter between sgk3-/- and sgk3+/+ BMMCs. Upon Ag stimulation via the FceRI receptor, Ca2+ entry but not Ca2+ release from intracellular stores was markedly impaired in sgk1-/-and sgk3-/- BMMCs. The currents through Ca2+-activated K+ channels induced by Ag were significantly higher in sgk1+/+ and sgk3+/+ BMMCs than in sgk1-/- and sgk3-/- cells, respectively. Treatment of the cells with Ca2+ ionophore ionomycin (1 µM) led to similar activation of the K+ channels in all tested genotypes, indicating that the Ca2+-activated K+ channels are similarly expressed and sensitive to activation by Ca2+ in sgk1-/- and sgk3-/- BMMCs as in their wt littermates, and that blunted stimulation of Ca2+-activated K+ channels was secondary to decreased Ca2+ entry. Compared to wild-type mice, IgE-Ag-induced degranulation of sgk1-/- and sgk3-/- BMMCs was significantly blunted. The decrease in body temperature following Ag treatment, which reflects anaphylactic reaction, was dramatically reduced in sgk1-/- and sgk3-/- mice, pointing to impaired mast cell function in vivo.

Thus, our observations disclose PI 3-kinase-dependent regulation of Ca2+- and Ca2+-activated K+-channels, which in turn participate in triggering mast cell degranulation. SGK1 and SGK3 are critically important for the regulation of Ca2+ entry, Ca2+-activated K+ channel activation and degranulation of mast cells upon IgE-Ag-dependent stimulation.

Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei IgE-abhängigen allergischen Reaktionen, einschließlich allergischer Rhinitis, anaphylaktischem Schock und Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ.

Die Vernetzung von IgE mit IgE-Rezeptoren (FceRI) auf der Mastzelloberfläche stimuliert den Einstrom von Ca2+ mit nachfolgender Freisetzung von Entzündungsmediatoren aus der Mastzelle. Ca2+ aktiviert Ca2+-abhängige K+-Kanäle, die ihrerseits den Ca2+-Einstrom ermöglichen. Der PI 3-Kinase Signalweg spielt eine zentrale Rolle bei der Stimulation von Mastzellen. Es ist bereit bekannt, dass PI 3-Kinase für die Mastzellaktivierung und Degranulierung benötigt wird. Die Serum- und Glucocorticoid-abhängigen Protein-Kinasen 1 (SGK1) und 3 (SGK3) werden via PI3-kinase aktiviert.

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der PI 3-Kinase in der Regulation von Ca2+- und Ca2+-abhängigen K+-Kanälen zu untersuchen und den möglichen Effekt auf die Mastzellfunktion zu studieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich zudem mit der Regulation von Ionenkanälen durch die Proteinkinasen SGK1 und SGK3 und dem daraus resultierenden Effekt auf die Funktion von Mastzellen.

Um diese Ziele zu erreichen, wurden aus dem Knochenmark von Mäusen isolierte, unbehandelte und mit LY-294002 behandelte Mastzellen mit Hilfe der Patch Clamp-Technik sowie Fura-2-Fluoreszenzmessungen zur Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen untersucht. Der durch FceRI-Quervernetzung ausgelöste Ca2+-Einstrom konnte durch Inhibition der PI 3-Kinase mit LY-294002 deutlich gehemmt werden, während die Freisetzung von Ca2+ aus den intrazellulären Speichern unverändert blieb. Der durch die Entleerung der intrazellulären Ca2+ Speicher mit Thapsigargin ausgelöste Einstrom von extrazellulärem Ca2+ wurde ebenfalls mit LY-294002 reduziert, was auf die Regulation von Speicher-abhängigen Kanälen (store-operated channels, SOCs) durch die PI 3-Kinase hinweist. Weiterhin hatte die Inhibierung der PI 3-Kinase eine reduzierte IgE-Ag-induzierte Stimulation von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen zufolge, während die Ionomycin-induzierte Stimulation von Ca2+-abhängige K+-Kanälen unverändert blieb.

Um die Rolle von SGK1 und SGK3 zu untersuchen, wurden die Mastzellen aus dem Knochenmark von SGK1 und SGK3 Knockout- und Wildtyp-Mäusen isoliert. Mittels Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass sgk1-/- Mastzellen signifikant kleiner waren als die entsprechenden Wildtyp-Zellen. Zwischen sgk3-/- und sgk3+/+ Mastzellen gab es dagegen keine wesentlichen Unterschiede im Zellvolumen. Nach Stimulation der Mastzellen mit IgE und Ag kam es zum gehemmten Ca2+-Einstrom, obwohl die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern unbeeinträchtigt war. Die Ag-induzierten Ströme durch Ca2+-abhängige K+-Kanäle waren signifikant höher in sgk1+/+ and sgk3+/+ Mastzellen im Vergleich zu sgk1-/- and sgk3-/-. Nach Zugabe des Ca2+-Ionophor Ionomycin (1 µM) wurden die K+-Kanäle in allen Zellen aktiviert, was darauf hinweist, dass Ca2+-abhängige K+-Kanäle in beiden Genotypen gleichermaßen exprimiert wurden und dieselbe Ca2+-Sensitivität aufwiesen. Demzufolge ist die verringerte Stimulation von Ca2+-abhängige K+-Kanälen ein sekundäres Ereignis und durch den reduzierten Ca2+-Einstrom bedingt. Die IgE-Ag induzierte Degranulierung war in sgk1-/- und sgk3-/- Mastzellen signifikant reduziert. Der Abfall der Körpertemperatur, welche als Parameter für die Allergische Reaktion dient, war in sgk1-/- and sgk3-/--Mäusen deutlich reduziert, was auf eine Beeinträchtigung der Mastzellfunktion in vivo hinweist.

Die hier dargestellten Untersuchungen haben gezeigt, dass die Regulation des Ca2+-Einstroms und von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen in Mastzellen durch die PI 3-Kinase reguliert werden. SGK1 und SGK3 spielen eine wichtige Rolle für die Regulation des Ca2+-Einstroms sowie der Aktivierung von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen und demzufolge für die Degranulierung von Mastzellen.