Regulation der Phosphoinositid 3 Kinase gamma-Isoformen durch Rezeptoren, Ras- und heterotrimere G-Proteine

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-41516
http://hdl.handle.net/10900/45485
Dokumentart: Dissertation
Date: 2009
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Nürnberg, Bernd (Prof. Dr. Dr.)
Day of Oral Examination: 2009-06-29
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Grün fluoreszierendes Protein , Signaltransduktion , G-Proteine , H-ras , Phosphatidylinositolkinase <Phosphatidylinositol-3-Kinase>
Other Keywords:
GFP , PI3K
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Die PI3Kgamma ist ein Phosphoinositol-3,4,5-Phosphat-bildendes Enzym, dass in Immunzellen von Säugern wesentliche Funktionen reguliert. Sie wird aber darüber hinaus auch im Kardiovaskularsystem gefunden, wo sie u. a. an der Regulation der Herzkontraktion beteiligt sein soll. Aus diesem Grund wird die PI3Kgamma als potentielle Zielstruktur für die Behandlung von Autoimmun- und kardiovaskulären Erkrankungen diskutiert. Die PI3Kgamma ist im nicht-stimulierten Zustand weitgehend zytosolisch lokalisiert und besteht aus der katalytischen p110gamma Untereinheit sowie einer nichtkatalytischen Untereinheit, der p101 oder der erst kürzlich identifizierten p87 (oder p84). Die Regulation der PI3Kgamma erfolgt klassischerweise GiPCR-induziert, wobei ungeklärt ist, ob auch GPCRs, die an andere G-Proteine koppeln, hierzu fähig sind. Die Regulation erfolgt über Gbetagamma-Dimere, die mit beiden Untereinheiten der PI3Kgamma spezifisch interagieren. So bewirkt Gbetagamma gleichzeitig sowohl durch Bindung an p101 eine Membranrekrutierung der Kinase als auch durch Interaktion mit p110gamma eine allosterische Stimulation. Für das PI3Kgammap87 Heterodimer wird ein analoger Mechanismus vermutet. Ein weiterer direkter Interaktionspartner ist Ras. Jedoch ist seine Funktion nur unvollständig verstanden. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es daher (1.) eine mögliche Regulation der PI3Kgamma durch primär Gi-, Gs- und Gq-Protein-gekoppelte Rezeptoren vergleichend zu untersuchen. (2.) Die Existenz zweier nichtkatalytischer Untereinheiten deutet auf eine differenzierte Funktion der beiden PI3Kgamma-Isoformen hin. Deshalb sollte die Bedeutung der beiden nichtkatalytischen Untereinheiten für die Enzymfunktion analysiert werden (3.) Weiterhin sollte der Wirkung von Ras auf die verschiedenen PI3Kgamma-Isoformen analysiert werden. Die Untersuchungen erfolgten an lebenden Zellen mithilfe konfokalmikroskopischer Visualisierungen Fluoreszenz-markierter Proteine. Parallel wurden proteinbiochemische Analyseverfahren gereinigter und rekonstitutierter Proteine eingesetzt. Übereinstimmend zeigen die Versuchsergebnisse in überexpremierten HEK 293-Zellen bzw. im endogenen HL-1 Zellsystem die prinzipielle Fähigkeit aller getesteten GPCRs, unabhängig von ihrem G-Protein-Kopplungsmuster die PI3Kgamma zu aktivieren. Jedoch fallen deutliche quantitative Unterschiede auf, die vermuten lassen, dass die Fähigkeit von GPCRs zur PI3Kgamma-Stimulation von der Menge an freigesetzten Gbetagamma Dimeren abhängt. Neben Gbetagamma aktiviert auch Ras die PI3Kgamma durch direkte Interaktion mit der p110gamma-Untereinheit. Hierbei ist ein Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Stimulation und dem Umfang der Membranassoziation der PI3Kgamma festzustellen. Wir konnten erstmals zeigen, dass Ras nicht nur das Enzym allosterisch stimuliert sondern auch an Membranenn rekrutieren kann. Interessanterweise hat diese Fähigkeit eine unterschiedliche Bedeutung auf die G Protein-vermittelte Aktivierung der beiden PI3Kgamma -Isoformen. Für die beiden nichtkatalytischen Untereinheiten p87 und p101 wird als Hauptfunktion die Vermittlung der Membranrekrutierung durch Gbetagamma im Sinne eines Adapters angenommen. Überraschenderweise konnten wir erstmals nachweisen, dass die p87 nicht als Gbetagamma-Adapter fungiert. Stattdessen kann GTP-gebundenes Ras die erforderliche Rekrutierung der PI3Kgammap87 ermöglichen und so die fehlende Adapterfunktion der p101 substituieren. Folglich war in dem hier verwendeten System eine Rezeptor-induzierte Stimulation der PI3Kgammap87 nur durch eine koinzidenten Stimulation durch Gbetagamma und Ras möglich, während die PI3Kgammap101 auch alleinig durch Gbetagamma effizient stimulierbar war. Somit konnten wir erstmals eine differenzierte Regulation der beiden PI3Kgamma-Isoformen nachweisen. Der in dieser Arbeit erbrachte Nachweis einer unterschiedlichen Regulation der beiden Isoformen, lässt auf der einen Seite die Existenz unterschiedlicher Funktionen der beiden PI3Kgamma-Isoformen wahrscheinlich erscheinen, andererseits liefern diese neuen Erkenntnisse die Grundlage für eine gezielte Isoform-, Rezeptor-, Zeit- oder Gewebe-spezifische Inhibition der PI3Kgamma.

Abstract:

Aim of the thesis was to illuminate molecular mechanisms underlying G-protein-coupled receptor-, Gbetagamma- and Ras-dependent regulation of the two phosphoinositide 3-kinases gamma heterodimers; i.e. p110gamma/p87 and p110gamma/p101. Our findings indicate firstly that GPCR-mediated PI3Kgamma activation does not depend on the G Protein isoform but most probably on the amount of Gbetagamma released. Secondly, the role of Ras in the stimulation process of PI3Kgamma is not only to activate, but also to recruit the lipid kinase to membranes. Furthermore, p87 and p101 exhibit an auxiliary effect on Ras-dependent activity of p110gamma. In conclusion we postulate that Ras is indispensable for the recruitment and activation of the heterodimeric p110gamma/p87.

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