Proteomuntersuchungen am humanpathogenen Bakterium Bartonella henselae

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-40836
http://hdl.handle.net/10900/45471
Dokumentart: Dissertation
Date: 2009
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Sonstige
Interfakultäres Institut für Biochemie (IFIB)
Advisor: Kempf, Volkhard A. J. (Prof. Dr. med.)
Day of Oral Examination: 2009-05-13
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Proteom , Proteomanalyse
Other Keywords: Bartonella henselae , 2D-Proteomkarte , 2D-Immunoproteomics
2D proteome map
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Inhaltszusammenfassung:

Bei immunkompetenten Patienten führen Infektionen mit Bartonella henselae meist zur sogenannten Katzenkratzkrankheit (KKK), einer selbstlimitierenden Lymphadenitis. Die vaskuloproliferativen Krankheitsbilder Bazilläre Angiomatose (BA) und Peliosis hepatis (PH) treten vorrangig bei immunsupprimierten Patienten auf. Dabei stellen die Endothelzellen die Zielzellen einer B. henselae-Infektion dar. In dieser Arbeit wurde zunächst das B. henselae-Proteom mittels zweidimensionaler 2D-SDS-PAGE und MALDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert und eine umfassende 2D Proteomkarte vom gesamten B. henselae-Proteom erstellt. Es wurden 431 Proteinpunkte identifiziert, die insgesamt 191 verschiedene Proteine repräsentieren - darunter auch 16 bislang hypothetische Proteine. Die Standardmethode zum Nachweis einer B. henselae-Infektion basiert auf dem indirekten Immunfluoreszenz-Test (IFT), jedoch bedarf die B. henselae-Serodiagnostik aufgrund von Kreuzreaktivitäten mit anderen intrazellulären pathogenen Bakterien weiterer Verbesserung. Als nächstes wurde die humorale Immunantwort gegenüber B. henselae mittels 2D-SDS-PAGE und anschließendem Immunoblot-Verfahren anhand von 33 Seren von Patienten mit serologisch bestätigter B. henselae-Infektion analysiert und erbrachte den Nachweis zahlreicher immunreaktiver B. henselae-Antigene. Einen definierten Schwellenwert von 20% Seroreaktivität erreichten 11 identifizierte sowie 4 bislang noch nicht identifizierte Proteine und stellen somit immundominante, für eine verbesserte Bartonella-spezifische Serodiagnostik nützliche Proteine dar. Besonders die Proteine GI 49475876 und die Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase GI 49475012 erwiesen sich als B. henselae-spezifische Antigene und sind somit vielversprechende, serodiagnostische Markerproteine einer B. henselae-Infektion. Die humorale Immunantwort gegenüber B. henselae variierte zwischen den Patienten, und es wird offenbar bei einer B. henselae-Infektion kein charakteristisches, abgrenzbares Antikörperprofil gegenüber eines einzelnen bestimmten B. henselae-Antigens entwickelt. Daher dürfte erst eine Zusammenstellung von immundominanten B. henselae-Seromarkern zufriedenstellende Ergebnisse bei einer zukünftigen B. henselae-Serodiagnostik ergeben. In dieser Arbeit wird eine Kombination von drei immundominanten B. henselae-Proteinen vorgeschlagen - die hier identifizierten Seromarker-Proteine GI 49475876 und die Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase GI 49475012 sowie das zurückliegend beschriebene Bartonella-Adhäsin A - um zukünftig eine verbesserte, zuverlässige und spezifische Serodiagnostik von B. henselae-Infektionen zu entwickeln. Weiterhin wurde das B. henselae-Proteom im Infektionsverlauf mit vaskulären Endothelzellen (HUVECs) mittels 35S-radioaktiver Markierung und anschließender 2D-SDS-PAGE untersucht. Bakterielle Proteine, die während der Infektion reguliert werden, erscheinen dabei als unterschiedlich stark auftretende 35S radioaktive Proteinpunkte auf den 2D-Gelen zwischen den zwei Vergleichszuständen (B. henselae –/+ HUVECs). Insgesamt konnten 16 dieser regulierten B. henselae-Proteine mittels MALDI-TOF-MS identifiziert werden - darunter befinden sich auch drei weitere hypothetische, bislang nicht charakterisierte Proteine. Diese regulierten B. henselae-Proteine sollten zukünftig neue detaillierte Einsichten in die Infektionsbiologie von B. henselae eröffnen, z.B. weist die in Gegenwart mit HUVECs verstärkt exprimierte Phosphoserin-Aminotransferase SerC darauf hin, dass intrazelluläre B. henselae verstärkt Aminosäuren als Energiequelle katabolisieren.

Abstract:

In immunocompetent patients infections with B. henselae usually result in cat scratch disease (CSD), an often self-limiting lymphadenitis. The vasculoproliferative disorders bacillary angiomatosis (BA) and bacillary peliosis hepatis (PH) predominantly occur in immunocompromised patients. Thereby the endothelial cells represent the target cells of a B. henselae infection. In this study, at first the whole proteome of B. henselae was characterized using 2D-SDS-PAGE and MALDI-TOF mass spectrometry and a comprehensive 2D proteome reference map of the B. henselae-proteome is provided. In total, 431 protein spots were identified representing 191 different proteins - amongst them 16 so far hypothetical proteins. The standard method for the detection of a B. henselae infection is based on an indirect immunofluorescence assay (IFA), whereas B. henselae serodiagnosis needs further improvement due to cross-reactivities to other intracellular pathogenic bacteria. Next, the humoral immune response against B. henselae of 33 sera from patients suffering from a serologically confirmed B. henselae-infection was assessed by means of 2D-SDS-PAGE and subsequent immunoblotting and enabled the detection of numerous immunoreactive B. henselae antigens. A defined threshold of 20% seroreactivity was reached by 11 identified and 4 so far unidentified proteins hence representing immunodominant, potentially useful proteins for an improved Bartonella-specific serodiagnosis. Especially the proteins GI 49475876 and the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase GI 49475012 proved to be B. henselae-specific antigens and are consequently promising, serodiagnostic marker proteins for a B. henselae infection. The humoral immune response against B. henselae varied between patients and there is apparently no characteristic, distinct antibody profile towards one certain B. henselae antigen developed in a B. henselae infection. Therefore, only a combination of immunodominant seromarkers might deliver satisfactory results in future B. henselae serodiagnosis. This study suggests a combination of three immunodominant B. henselae proteins - two herein identified seromarker proteins GI 49475876 and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase GI 49475012 as well as the formerly described Bartonella adhesin A - to develop an improved, dependable and specific serodiagnosis of B. henselae infections. Further, the B. henselae proteome in the course of infection with vascular endothelial cells (HUVECs) was investigated by means of 35S-radioactive labelling and subsequent 2D-SDS-PAGE. Throughout the infection regulated bacterial proteins appear as differentially intense 35S radioactive protein spots on the 2D-gels between two comparable conditions (B. henselae –/+ HUVECs). In total, 16 regulated proteins were identified by MALDI-TOF-MS - amongst them three hypothetical, so far not characterized proteins. In future, these regulated proteins should allow detailed insights in the infection biology of this pathogen, e.g. the increased expression of the phosphoserine aminotransferase SerC in the presence of HUVECs indicates, that intracellular B. henselae catabolize intensely aminoacids as energy source.

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