Charakterisierung der Interaktion von Akt mit XIAP-associated factor 1 (Xaf1)

Abstract

Im Hefe-2-Hybrid-System wurde XIAP-associated factor 1 (Xaf1) als Interaktionspartner von Akt gefunden. Bei Xaf1 handelt es sich um ein Protein, das über verschiedene Mechanismen pro-apoptotisch wirkt. Die Akt-Kinase ist hingegen anti-apoptotisch und spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle bei der Insulin-Signaltransduktion und weiteren zellulären Funktionen. Die Interaktion von Xaf1 wurde in humanen Zellen für Akt 1 und Akt 2 bestätigt, nicht aber für Akt 3. Im Vergleich zu anderen Akt-interagierenden Proteinen war Xaf1 ein starker Bindungspartner. Weiter konnten die Interaktionsbereiche von Xaf1, Akt1 und XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) definiert und Expressionskonstrukte ohne die interagierenden Bereiche hergestellt werden. Diese Konstrukte wurden anschließend in Zellen stabil überexprimiert. Darin führte Xaf 1 zu einer verstärkten Phosphorylierung von Akt und von weiteren Proteinen des Phosphoinositid-3-Kinase (PI-3-Kinase)-Stoffwechselweges. Die Interaktion bewirkte außerdem eine Veränderung der intrazellulären Lokalisation der Proteine. Zudem erhöhte die Akt-Xaf1-Interaktion die Apoptoserate. Die funktionelle Charakterisierung lieferte also Hinweise auf eine Bedeutung dieser Protein-Interaktion für den PI-3-Kinase-Akt-Signalweg, die intrazelluläre Lokalisation der Proteine und die Apoptose.

Using a yeast-two-hybrid approach, XIAP-associated factor 1 (Xaf1) was identified as an Akt-interacting protein. Xaf1 is pro-apoptotic via different mechanisms. By contrast, Akt kinase is anti-apoptotic and is also involved in insulin signaling and various other cellular functions. This work confirmed an interaction between Xaf1 and both Akt1 and Akt2 but not with Akt3 in human cells. When comparing with other Akt interacting proteins, Xaf1 is a strong binding partner. Furthermore, we determined the interacting domains of Xaf1, Akt1, and XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) and produced expression constructs lacking these domains. These constructs were then stably expressed in cell lines. In these cells, Xaf1 increased phosphorylation of Akt and additional proteins involved in the phosphoinositide 3 (PI-3)-kinase pathway. In addition, the interaction led to altered intracellular localization of the proteins. Moreover, Akt-Xaf1 interaction increased the rate of apoptosis. This functional characterization provides evidence for a role of this protein interaction in PI-3-kinase / Akt signaling, in the intracellular localization of the proteins, and in apoptosis.