ATP release from vascular endothelia occurs through connexin 43 and is attenuated during hypoxia

Abstract

Hintergrund: Extrazelluläres ATP ist ein wichtiges Signalmolekül während der endothelialen Adapation an ein vermindertes Sauerstoffangebot (Hypoxie). In dieser Arbeit untersuchten wir den Zusammenhang zwischen dem Gefäßendothel und der extrazellulären ATP Freisetzung unter hypoxischen Bedingungen.

Methodik, Ergebnisse: Zunächst untersuchten wir die endotheliale ATP-Freisetzung an HMEC-1, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt waren. Erstaunlicherweise zeigte sich eine signifikant verminderte ATP Freisetzung über die Dauer der Exposition (2% Sauerstoff, 22±3% nach 48h). Im Gegensatz dazu, blieb die intrazelluläre ATP-Konzentration unverändert. Die LDH Freisetzung in den Mediumüberstand war vergleichbar zwischen den normoxischen und hypoxischen Endothelzellen, so dass lytische Prozesse für die ATP Freisetzung als geringfügig angesehen werden können. In den folgenden Versuchen verwendeten wir Inhibitoren um mögliche Mechanismen der endothelialen ATP Freisetzung zu untersuchen (u.a. Verapamil, Dipyridamole, 18-alpha GA, Anandamid, Connexin mimetic peptides). Diese Versuche zeigten, dass die ATP Freisetzung des Endothels zumindest teilweise durch Connexin 43 (Cx43) stattfindet. Ein Screening auf endotheliale Connexine mittels real-time RT-PCR zeigte eine selektive Repression von Cx43. Anschließende Untersuchungen ergaben eine zeitabhängige Verminderung von Cx43 auf m-RNA-, Total- und Oberflächenprotein- Ebene unter hypoxischen Bedingungen. Zusätzlich führte die Hypoxie zu einer Cx43-serine368 Phosphorylation, die dafür bekannt ist, Cx43 von einem offenen in den geschlossen Zustand zu überführen.

Zusammenfassung: Diese Versuche lassen vermuten, dass Cx43 eine Rolle in der verminderten endothelialen Freisetzung von ATP unter hypoxischen Bedingungen spielt.

Background: Extracellular ATP is an important signaling molecule for vascular adaptation to limited oxygen availability (hypoxia). Here, we pursued the contribution of vascular endothelia to extracellular ATP release under hypoxic conditions.

Methodology, Principal Findings: We gained first insight from studying ATP release from endothelia (HMEC-1) pre-exposed to hypoxia. Surprisingly, we found that ATP release was significantly attenuated following hypoxia exposure (2% oxygen, 22±3% after 48h). In contrast, intracellular ATP was unchanged. Similarly, lactate-dehydrogenase release into the supernatants was similar between normoxic or hypoxic endothelia, suggesting that differences in lytic ATP release between normoxia or hypoxia are minimal. Next, we used pharmacological strategies to study potential mechanisms for endothelial-dependent ATP release (eg, verapamil, dipyridamole, 18-alpha-glycyrrhetinic acid, anandamide, connexin-mimetic peptides). These studies revealed that endothelial ATP release occurs – at least in part - through connexin 43 (Cx43) hemichannels. A real-time RT-PCR screen of endothelial connexin expression showed selective repression of Cx43 transcript and additional studies confirmed time-dependent Cx43 mRNA, total and surface protein repression during hypoxia. In addition, hypoxia resulted in Cx43-serine368 phosphorylation, which is known to switch Cx43 hemi-channels from an open to a closed state.

Conclusions/Significance: Taken together, these studies implicate endothelial Cx43 in hypoxia-associated repression of endothelial ATP release.