Systematische in vitro Charakterisierung des Photosensibilisators Hypericin für die Photodynamische Therapie von malignen Gliomen

Abstract

Gliome imponieren morphologisch durch Heterogenität und diffus-infiltrierendes Wachstum. Die Prognose ist bei einer mittleren Überlebenszeit von weniger als 6 Monaten erschreckend. Somit ist eine exakte nicht nur präoperative, sondern vor allem intraoperative Tumoridentifizierung und -lokalisierung für einen radikalen chirurgischen Eingriff erforderlich. Weiterhin sind suffizientere adjuvante Therapieformen zur Verlängerung der Überlebenszeit, und auch für eine humane palliative Verbesserung der Lebensqualität gefragt. Die photodynamische Therapie ist ein hierfür geeignetes Verfahren in der Tumortherapie, welches Tumorgewebe selektiv zu schädigen vermag. Als Fluoreszenzmarker und auch als Photosensibilisator ist die Substanz Hypericin optimal für eine intraoperative wie auch adjuvante photodynamische Anwendung bei malignen Gliomen. Diese These konnte im Rahmen dieser Arbeit mittels einer standardisierten in-vitro-Charakterisierung von Hypericin unter Anwendung quantitativer (FACS) und qualitativer Messverfahren (Fluoreszenzmikroskopie) bestätigt werden. Bei der Evaluation der optimalen Inkubationskonzentration für alle weiteren Experimente erwiesen sich 2.5 microM Hypericin unter dem Aspekt einer geringen Zytotoxizität am optimalsten. Die zytotoxischen Effekte von Hypericin erwiesen sich bei allen Experimenten als äußerst gering und waren allenfalls bei ansteigenden Inkubationskonzentrationen (> 5 microM) oder längeren Inkubationszeiten (24 Stunden) zu beobachten. Die Zellvitalität betrug hierbei jedoch für sämtliche Versuche und alle Zelllinien nie weniger als 87,5% für eine maximale Inkubationskonzentration mit 10 microM Hypericin. Versuche zur intrazellulären Akkumulation von Hypericin ergaben eine optimale Inkubationszeit von 2 Stunden für alle weiterführenden Experimente. Es zeigte sich ein Anstieg der zellulären Fluoreszenz bis zu einer Inkubationskonzentration von 5 microM. Inkubationskonzentrationen größer 5 microM resultierten in einem steady state. Somit erwiesen sich eine Hypericinkonzentration von 2.5 microM und eine Inkubationszeit von 2 Stunden als optimale Parameter für die im Anschluss erfolgten Experimente zur Phototoxizität. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Transportmechanismus von Hypericin um einen energieabhängigen und somit aktiven Transport mittels rezeptorvermittelter Pino- oder Endozytose handelt. Hypericin besitzt die Eigenschaften der minimalen Zytotoxizität sowie der maximalen Phototoxizität und ist also für eine PDT von zweifachem Vorteil. Ein selbst generiertes Aktionsspektrum ergab eine optimale Wellenlänge von 595 nm für alle weiteren Versuche zur Phototoxizität von Hypericin. Eine Reduktion der Zellzahl um 50 % wurde bereits bei geringen Energiedichten zwischen 0.15 und 0.20 J/cm² (Inkubationskonzentration von nur 2.5 microM) erreicht. Bei den Untersuchungen zur Zytotoxizität hatte sich bereits eine erhöhte Sensitivität der Zelllinie U373 MG im Vergleich zu den anderen Zelllinien (LN 229 und T98G) gezeigt. Auch bei den Experimenten zur Photoxizität erwies sich diese Zelllinie erneut als sensitiver. Dies spricht für das Vorliegen eines Zusammenhanges zwischen intrazellulärer Akkumulation und photodynamischem Effekt. Die qualitative Bestimmung der intrazellulären Lokalisation von Hypericin zeigte, dass sich die Substanz massgeblich in der perinukleären Region und der Nukleusmembran akkumuliert. Mittels der Methode der TIRFM konnte bewiesen werden, dass sich Hypericin aufgrund seiner Lipophilie ebenfalls in der Plasmamembran anreichert. Eine Lokalisation von Hypericin in Mitochondrien und/oder Lysosomen konnte im Rahmen dieser Arbeit ausgeschlossen werden. Unter Zusammenschau aller durchgeführten Experimente kann subsummiert werden, dass Hypericin einen geeigneten, minimal zytotoxischen und maximal phototoxischen Photosensibilisator für eine effektive PDT bei malignen Gliomen darstellt.

Glioma are known to grow quickly through diffuse and aggressive infiltration of brain tissue. Hence the resulting poor prognosis of patients suffering from malignant glioma requires further efforts. Photodynamic therapy (PDT) might be a therapeutic option to increase surgical radicality and has become more important in the field of treatment in oncology. Hypericin (HY), with the special characteristics of being not only a photosensitiser, but also a fluorescence marker, exhibit high phototoxicity to malignant cells and accumulates to a higher extent in glioblastoma cells as compared to neurons. Therefore, the impact of various experimental parameters on cytotoxicity, intracellular accumulation and phototoxicity of HY was quantitatively assessed in the three human glioblastoma cell lines U373 MG, LN229 and T98G. Additionally, intracellular location of HY was studied with fluorescence microscopic techniques. For all three cell lines, no cytotoxicity was found for incubation concentrations up to 5 microM. For short-time incubation (2 h), maximum HY fluorescence was achieved at an incubation concentration of about 5 microM. However, uptake kinetics of HY was dependent on its incubation concentration. Moreover, increase in HY fluorescence was negligible at 4 degrees C, which strongly indicates that the compound is taken up by an energy-dependent process such as endo-or pinocytosis. HY exhibited high phototoxicity (at 595 nm) in all three cell lines with ID50-values ranging from 0.15 J/cm(2) to 0.22 J/cm(2), but sensitivity decreased in the order U373 MG > LN229 > T98G. However, assessment of phototoxicity at different wavelengths revealed that highest cell inactivation was achieved at 600 nm. Fluorescence microscopy showed that HY fluorescence arose predominantly from the perinuclear region and the nuclear membrane. Fluorescence pattern of HY was significantly different from those observed for organelle markers staining lysosomes or mitochondria. Location of HY in the plasma membrane was proven by total internal reflection fluorescence microscopy. Thus, the present study demonstrates that glioblastoma cells can be effectively inactivated by HY-PDT after short-time incubation and exposure to low light doses. These results obtained in cell culture are encouraging and justify further evaluation HY-PDT for the treatment of malignant glioma in animal experiments.