Identifizierung Apoptose-induzierender Alkaloide der Pflanze Chelidonium Majus und des Präparates Ukrain in einem Lymphom-Modell

Abstract

Für das Krebsmedikament Ukrain, von Herstellerseite als semisynthetisches Derivat aus dem Schöllkraut-Alkaloid Chelidonin und dem Alkylanz Thiotepa beschrieben, wurde eine selektive zytotoxische Wirkung auf humane Tumor-Zelllinien in vitro beschrieben. Auch einige klinische Studien berichten über eine positive Wirkung des Präparates in der onkologischen Therapie. Allerdings werden Wirksamkeit und Zusammensetzung des Präparates kontrovers diskutiert.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der Bedeutung der Apoptose-Induktion für die potentielle anti-neoplastische Aktivität von Ukrain sowie der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zelltodinduktion. Weiterhin sollten in Zusammenarbeit mit dem Institut für Klinische Pharmakologie des Universitätsklinikums Tübingen die chemischen Bestandteile des Präparates analysiert werden. Die Induktion der Apoptose wurde in einem Jurkat T-Lymphom-Modell mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie (Chromatin-Kondensierung und nukleäre Fragmentierung), Durchflusszytometrie (Änderung der Zellmorphologie, Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials, Caspasen-Aktivierung) und Western-Blot-Analysen (Caspasen-Aktivierung, PARP-Spaltung) untersucht. Die chemische Analyse von Ukrain sowie eines nativen Schöllkrautextrakts erfolgte mittels Massenspektrometrie und LC-MS-Kopplung (Datenmaterial Dr. Bernd Kammerer, Klinische Pharmakologie, Universität Tübingen). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Ukrain in einem Jurkat T-Lymphom-Modell Apoptose induziert. Untersuchungen hinsichtlich beteiligter intrazellulärer Signalwege machten deutlich, dass die Ukrain-Behandlung zu einer Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials sowie zur Aktivierung von Caspasen führte. Ein Fehlen von Caspase-8, Expression von c-FLIP-L und Resistenz gegenüber der Todesrezeptorligand-induzierten Apoptose führte nicht zu einer Inhibition der Ukrain-induzierten Apoptose. Desweiteren bewirkte ein Fehlen des Adapterproteins FADD nur eine Verzögerung, nicht jedoch eine Aufhebung der Ukrain-induzierten Apoptose. Diese Befunde deuten darauf hin, dass der Todesrezeptor-Signalweg nicht essentiell für die Ukrain-induzierte Apoptose ist. Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL und Expression einer dominant-negativen Caspase-9 konnte die Ukrain-induzierte Apoptose dagegen zumindest teilweise hemmen, was auf die bedeutung des mitochondrialen Signalweg für die zytotoxische Wirksamkeit von Ukrain hindeutet. Da die chemische Analyse von Ukrain ergab, dass Ukrain ein Gemisch verschiedener Alkaloide der Pflanze Schöllkraut, darunter Chelidonin, Chelerythrin, Protopin, Sanguinarin und Allokryptopin, darstellt, wurde in weiteren Analysen die zytotoxische Wirksamkeit dieser Alkaloide sowie eines kommerziell erhältlichen Schöllkrautextrakts analysiert. Diese Untersuchungen zeigten, dass Chelerythrin, Sanguinarin und Protopin ebenfalls Apoptose und teilweise auch Nekrose in den behandelten Zellen auslösen. Anwesenheit der anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 oder Bcl-xL verminderten ebenso wie bei Ukrain die Apoptoserate deutlich, was eine Beteiligung des mitochondrialen Apoptose-Signalweges impliziert. Insbesondere das Schöllkraut-Hauptalkaloid Chelidonin stellte sich als potente zytotoxische Substanz heraus. Ähnlich wie Ukrain induziert auch Chelidonin Apoptose über Bcl-2-abhängige mitochondriale Veränderungen und Caspasen-Aktivierung. Obwohl sowohl Chelidonin als auch Ukrain auch in nicht-malignen humanen Konjunktivalepithelzellen Apoptose auslösten, zeigten die Normalgewebs-zellen eine gegenüber den Tumorzellen verminderte Sensitivität.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass Ukrain potente zytotoxische Wirksamkeit besitzt. Die anti-neoplastische Wirkung von Ukrain ist allerdings durch die zytotoxische Wirkung bekannter Schöllkrautalkaloide bedingt und nicht durch das von Herstellerseite suggerierte "Ukrain-Molekül". Insbesondere das Schöllkraut-Hauptalkaloid Chelidonin zeichnet sich hierbei durch potente Apoptoseinduktion im untersuchten Jurkat T-Lymphom-Modell aus.

Aufgrund der falschen Herstellerangaben zur Zusammensetzung ist Ukrain für die weitere klinische Entwicklung nicht geeignet. Dagegen erscheint eine weitere Charakterisierung der antineoplastischen Eigenschaften einzelner Schöllkraut-alkaloide in präklinischen Modellen sinnvoll.

The anticancer drug Ukrain which has been specified by the manufacturer as semisynthetic derivative of the Chelidonium majus L. alkaloid chelidonine and the alkylans thiotepa was reported to exert selective cytotoxic effects on human tumour cell lines in vitro. Few clinical trials suggest beneficial effects in the treatment of human cancer. However, there is still a controversial debate on the efficacy and composition of the drug preparation.

Aim of the present study was to elucidate the importance of apoptosis induction for the potential antineoplastic activity of Ukrain and to define the underlying molecular mechanisms of cell death. Furthermore an analysis of the chemical compounds of the drug preparation should be performed in cooperation with the Department of Clinical Pharmacology of the University Hospital Tuebingen. Apoptosis induction was analysed in a Jurkat T-lymphoma cell model by fluorescence microscopy (chromatin condensation and nuclear fragmentation), flow cytometry (cellular shrinkage, depolarisation of the mitochondrial membrane potential, caspase-activation) and Western blot analysis (caspase-activation). Chemical analysis of Ukrain and a native extract of Chelidonium Majus L was performed by mass spectrometry and LC-MS-coupling (data provided by Dr. Bernd Kammerer, Department of Clinical Pharmacology, University Hospital Tuebingen). This work shows that Ukrain induces apoptosis in a Jurkat T-cell lymphoma model. Further analyses concerning intracellular signaling pathways revealed that Ukrain induced depolarisation of the mitochondrial membrane potential and activation of caspases. Lack of caspase-8, expression of cFLIP-L and resistance to death receptor ligand-induced apoptosis failed to inhibit Ukrain-induced apoptosis while lack of FADD caused a delay but not abrogation of Ukrain-induced apoptosis pointing to a death receptor independent signalling pathway. Over-expression of Bcl-2 or Bcl-xL and expression of dominant negative caspase-9 partially reduced Ukrain-induced apoptosis pointing to Bcl-2 controlled mitochondrial signalling events.

There was evidence that the anti-cancer drug Ukrain consists of a combination of several alklaoids derived from Chelidonium majus L. Available data on the analysis of both Ukrain and a native extract of Chelidonium majus L (mass spectrometry and LC-MS coupling) to elucidate their chemical identity consists of a combination of several alklaoids derived from Chelidonium majus L such as chelidonine, chelerythrine, protopine, sanguinarine and protopine. In further analyses on the cytotoxic activity of the identified alkaloids it was shown that chelerythrine, sanguinarine and protopine exerted pro-apoptotic effects but lead to a higher rate of necrotic cells as Ukrain did. In contrast Allocryptopine did not show a noticeable induction of apoptosis. Presence of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xl and expression of a dominat-negative caspase-9 inhibited drug-induced apoptosis and thus underlines the role of the intrinsic mitochondrial apoptosis pathway. Chelidonine, the main alkaloid of Chelidonium majus, turned out to be a potent inducer of apoptosis triggering cell death. Similar to Ukrain, apoptosis signalling of chelidonine involved Bcl-2 controlled mitochondrial alterations and caspase-activation. Although Chelidonine as well as Ukrain induces apoptosis in non-malignant human conjunctival epithelial cells, normal human cells showed a reduced sensitivity compared to tumour cells.

Finally this work suggests that the antineoplastic effects of Ukrain are based on pro-apoptotic alkaloid compounds of Chelidonium majus L and are not due to the suggested "Ukrain-molecule". Particularly Chelidonium majus L main alkaloid chelidonine was shown to be a potent inducer of apoptosis in a Jurkat T lymphoma model.

At the moment the drug preparation Ukrain seems not to be appropriate for further clinical investigation because of incorrect manufacturer´s specifications. However, a further characterisation of the observed anti-neoplastic effects of single Chelidonium Majus L alkaloids in preclinical models seems to be promising.