Perforinexpression bei humanen peripheren mononukleären Zellen nach anti-CD3 Stimulation –Zusammenhang mit Zellgröße und Zytotoxizität

Abstract

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) besitzen als Effektormechanismen das Perforin- und das Fas-System. Werden naive PMNC bzw. CD8+ Lymphozyten mit anti-CD3 stimuliert, so kann Perforin nach der Stimulation nur bei kleinen Zellen, nicht aber bei großen Blasten nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, mögliche Zusammenhänge zwischen der Blastenbildung und der Expression von Perforin festzustellen und den Anteil der perforinabhängigen Zytotoxizität bei stimulierten und unstimulierten humanen PMNC und CD8+ Lymphozyten zu ermitteln. Zellgröße und intrazelluläres Perforin wurden vor und nach einer 24-stündigen Stimulation mit anti-CD3 durchflusszytometrisch untersucht und die zytotoxische Wirkung durch Cr-Release-Assays mit CCRF-Lymphomzellen ermittelt. Durch spezifische Hemmstoffe gegen das Perforin- bzw. Fas-System wurde der jeweilige Anteil an der zytotoxischen Wirkung bestimmt. Ergänzend wurde der Zusammenhang zwischen der Expression des Aktivierungsmarkers CD25 und dem Nachweis von Perforin untersucht. Die zytotoxische Wirkung der unstimulierten Population, die auf Gedächtniszellen zurückgeführt werden kann, erwies sich als nahezu vollständig perforinabhängig. Nach der Stimulation war die Zytotoxizität verdoppelt und zu jeweils etwa 50% Perforin- bzw. Fas-abhängig. Blasten wurden als perforinnegativ bestätigt, was durch eine in der Literatur beschriebene Koppelung von Perforinexpression und Zellteilung begründet sein könnte. Fehlende Expression von CD25 ging mit einem dreifach höheren Anteil perforinpositiver Zellen einher und die zytotoxische Wirkung von CD25-negativen Zellen war im Gegensatz zu CD25-positiven Zellen vollständig perforinabhängig. Die gefundenen Unterschiede des Perforin- und Fas-Systems bei stimulierten und unstimulierten Zellen weisen auf unterschiedliche Regulationsmechanismen beider Systeme im Rahmen der Zellaktivierung hin.

Perforin and Fas ligand (FasL) pathways are the major mechanisms of T cell mediated cytotoxicity. After stimulation of peripheral mononuclear cells or CD 8 positive T cells with anti-CD3 antibodies, perforin can be found only in small cells whereas the majority of blasts proved to be perforin negative. The aim of this work was to detect potential connections between the development of blasts with perforin expression in stimulated and unstimulated PMNC and CD8 positive lymphocytes. Cell volume and intracellular perforin were analysed by means of FACS (fluorescence activated cell sorting), cytotoxicity was measured by Cr-release assays while blocking either perforin or fas pathway by specific antibodies. Additionally potential correlations between expression of activation markers, such as CD25, with perforin expression were analysed. Cytotoxicity of unstimulated cells, probably attributed to memory cells, was almost completely perforin dependent. After stimulation cytotoxicity doubled and was half perforin and half fas dependent. Blasts were confirmed as perforin negative cells. This might to be explained by connections between the development of cytotoxicity with cell proliferation as described in recent works. CD25 negative cells expressed tripply more perforin and their cytotoxicity was fully perforin dependent. Different importance of perforin and fas pathway in stimulated and unstimulated cells point to distinct regulatory mechanism while cell activation.