Die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase (SGK) in der Regulation intestinaler Transporter und Ionenkanäle

Abstract

Verschiedene Transporter bzw. Kanäle wie z. B. der renale epitheliale Natriumkanal ENaC werden nach Ubiquitinierung (Bindung von Ubiquitin an Prolin-reiche Aminosäuresequenzen wie z. B. das sogenannte PY-Motiv) durch die Ubiquitinligase Nedd4-2 über nachfolgenden Proteinabbau bzw. nachfolgende Endozytose herunterreguliert. Nedd4-2 selbst wird von der Serum- und Glukokortikoid-induzierbaren Kinase SGK1 durch Phosphorylierung inaktiviert, wodurch eine indirekte Aktivierung des jeweiligen Transporters/Kanals erfolgt. Einige Transporter werden durch direkte Phosphorylierung mittels SGK1 stimuliert. Mit der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, inwieweit der Natrium-Glukose-Kotransporter SGLT1, der anorganische Phosphattransporter NaPi IIb und der Chloridkanal ClC-2, die wie SGK1 und Nedd4-2 im Epithel des Darms exprimiert werden, von SGK1 und/oder Nedd4-2 bzw. den mit ihnen verwandten Isoformen/Mutanten beeinflusst werden. Nach Injektion der entsprechenden cRNA in Xenopus-laevis-Oozyten sowie drei- bis viertägiger Inkubation der Zellen wurden mit Hilfe der Voltage-clamp-Methode funktionelle Studien an den in diesen Oozyten exprimierten elektrogenen Transportern/Ionenkanälen SGLT1, NaPi IIb und ClC-2 durchgeführt. Bei SGLT1 wurde der durch 10 mM Glukose-Lösung, bei NaPi IIb der durch 3 mM Phosphat-Lösung und bei ClC-2 der durch Hyperpolarisation (-120 mV) induzierte Strom als Maß für die Aktivität des jeweiligen Transporters bzw. Kanals herangezogen. Der in die Glukoseaufnahme im Darm involvierte Transporter SGLT1 wurde von Nedd4-2 inhibiert und von SGK1 aktiviert. SGK1 hob bei Koexpression mit Nedd4-2 die Nedd4-2-Wirkung vollständig auf, vermutlich durch Phosphorylierung und damit Inaktivierung von Nedd4-2. Die inaktiven Mutanten C938SNedd4-2 und K127NSGK1 zeigten keine signifikante Beeinflussung der SGLT1-Aktivität. SGLT1 wurde auch durch die mit SGK1 verwandten Kinasen SGK3 und T308DS473DPKB und die konstitutiv aktive Form S422DSGK1 (im Gegensatz zu SGK2 und der inaktiven Mutante T308AS473APKB) stimuliert. SGLT1 besitzt keine der bislang bekannten für die Nedd4-2-Bindung erforderlichen Aminosäuresequenzen wie z. B. das PY-Motiv. Möglicherweise erfolgt eine Interaktion über Regulatorproteine wie das den spannungsgesteuerten Kaliumkanal Kv1.3 regulierende Protein KChAP, das eine PY-Sequenz enthält. Der für die intestinale Phosphatabsorption verantwortliche Natrium-Phosphat-Kotransporter NaPi IIb konnte in seiner Aktivität durch Nedd4-2 (im Unterschied zur inaktiven Mutante C938SNedd4-2) gehemmt und durch SGK1, die konstitutiv aktive Mutante S422DSGK1 sowie SGK3 angeregt werden. SGK2 und T308DS473DPKB vermochten wie die inaktive Mutante K127NSGK1 die NaPi IIb-Aktivität nicht zu beeinflussen. Koexpression von S422DSGK1 bzw. SGK3 mit Nedd4-2 resultierte im Gegensatz zur Koexpression von SGK2 bzw. T308DS473DPKB mit Nedd4-2 in einer vollständigen Aufhebung des inhibitorischen Nedd4-2-Effekts. Nedd4-2 und S422DSGK1 bewirkten eine Änderung der maximalen Transportrate Vmax, während die Affinitätskonstante Km unbeeinflusst blieb; dies deutet darauf hin, dass durch S422DSGK1 und Nedd4-2 die Anzahl der Transportermoleküle in der Zellmembran geändert wird und nicht die Aktivität eines einzelnen Transportermoleküls. Der Chloridkanal ClC-2, der eine wichtige Rolle bei Zellvolumenregulation, neuronaler Exzitabilität und Chloridsekretion spielt, ließ sich durch SGK1, SGK3 und T308DS473DPKB und geringer ausgeprägt auch durch SGK2 aktivieren. Durch Nedd4-2 ließ sich eine Hemmung des ClC-2-Stroms erzielen, die bei Koexpression mit SGK1, S422DSGK1, SGK2, SGK3 und T308DS473DPKB reversibel war. Ohne signifikante Wirkung auf ClC-2 blieben die inaktiven Mutanten T308AS473APKB und C938SNedd4-2. ClC-2 besitzt mit einem Serinrest an Position 82 eine mögliche Phosphorylierungsstelle für die SGK; die durch Substitution dieser Aminosäure durch Aspartat (Imitation der phosphorylierten Form) erzeugte Mutante S82DClC-2 wies im Unterschied zur Mutante S82AClC-2 (keine Phosphorylierungsstelle) signifikant höhere Ströme auf als Wildtyp-ClC-2; allerdings konnte bei beiden Mutanten durch Koexpression mit S422DSGK1 eine Zunahme des ClC-2-Stroms bewirkt werden; dies weist auf einen vermutlich vorhandenen zusätzlichen Regulationsmechanismus hin. Diese hier aufgeführten Ergebnisse könnten einen neuartigen Regulationsmechanismus darstellen, nach welchem die Transporter/Kanäle SGLT1, NaPi IIb und ClC-2 durch Nedd4-2 gehemmt und (indirekt) durch Inaktivierung von Nedd4-2 mittels SGK stimuliert werden.

Various transporters and ion channels such as the renal epithelial sodium channel ENaC are down-regulated after ubiquitination (binding of ubiquitin to prolin-rich amino acid sequences such as the so-called PY motif) by the ubiquitin ligase Nedd4-2 through subsequent degradation of the protein or subsequent endocytosis. Nedd4-2 is itself inactivated by phosphorylation by serum and glucocorticoid inducible kinase SGK1, which leads to an indirect activation of the respective transporter or channel. Some transporters are stimulated by direct phosphorylation by SGK1. The present study undertook to search for a role of SGK1 and/or Nedd4-2 and their related isoforms/mutants in the regulation of the sodium glucose co-transporter SGLT1, the inorganic phosphate transporter NaPi IIb and the chloride channel ClC-2 which are all expressed in intestinal mucosal epithelium. Xenopus laevis oocytes were injected with the respective cRNA and incubated for three to four days. Functional voltage-clamp experiments were then performed with the expressed electrogenic transporters/ion channels SGLT1, NaPi IIb and ClC-2. The glucose (10 mM)-induced current, phosphate (3 mM)-induced current and the hyperpolarization (-120 mV) activated current were taken as measures of activity of the transporters/channels SGLT1, NaPi IIb and ClC-2 respectively. The glucose transporter SGLT1 (involved in intestinal glucose absorption) was inhibited by Nedd4-2 and activated by SGK1. Upon co-expression with Nedd4-2, SGK1 fully reversed the effect of Nedd4-2, presumably by phosphorylation and thereby inactivation of Nedd4-2. The inactive mutants C938SNedd4-2 and K127NSGK1 had no significant influence in SGLT1 activity. SGLT1 was stimulated by the related kinases SGK3, T308DS473DPKB and the constitutively active form S422DSGK1. In contrast, this effect on SGLT1 was not shown with SGK2 and the inactive mutant T308AS473APKB. SGLT1 does not contain any of the amino acid sequences known to be necessary for Nedd4-2 binding, such as the PY motif. Interaction might originate from regulatory proteins such as KChAP which contains a PY sequence and which regulates the voltage gated potassium channel Kv1.3. The sodium phosphate co-transporter NaPi IIb, which is responsible for intestinal phosphate absorption, was inhibited by Nedd4-2, though not by the inactive mutant C938SNedd4-2, and was stimulated by SGK1, the constitutively active mutant S422DSGK1 and SGK3. SGK2, T308DS473DPKB and the inactive mutant K127NSGK1 did not show the ability to modulate NaPi IIb activity. Co-expression of S422DSGK1 or SGK3 with Nedd4-2 resulted in a complete abolition of the inhibitory Nedd4-2 effect. Nedd4-2 and S422DSGK1 caused a change in the maximal transport rate Vmax while leaving the affinity constant Km unaffected; this indicates that S422DSGK1 and Nedd4-2 cause an altered transporter abundance in the cell membrane but do not affect the activity of single transporter molecules. The chloride channel ClC-2, which plays an important role in cell volume regulation, neuronal excitability and chloride secretion, could be activated by SGK1, SGK3, T308DS473DPKB and, to a lesser extend, by SGK2. An inhibition of ClC-2 current could be achieved by Nedd4-2 and this was reversible upon co-expression with SGK1, S422DSGK1, SGK2, SGK3 and T308DS473DPKB. The inactive mutants T308AS473APKB and C938SNedd4-2 showed no significant effect on ClC-2. With the amino acid serine at position 82, ClC-2 contains a putative phosphorylation site for SGK. Replacement of this amino acid by aspartate (mimicking the phosphorylated form) results in the S82DClC-2 mutant. This revealed significantly higher currents than wild type ClC-2, while the S82AClC-2 mutant lacking the phosphorylation site did not. Nevertheless co-expression of both mutants with S422DSGK1 caused an increase in ClC-2 current suggesting the existence of an additional regulatory mechanism. These observations may disclose a novel regulatory mechanism according to which the transporters/channels SGLT1, NaPi IIb and ClC-2 are inhibited by Nedd4-2 and are (indirectly) stimulated by the inactivation of Nedd4-2 by SGK.