Die differentielle Expression verschiedener mRNA-Varianten von Hif1alpha unter Ausdauerbelastung und normobarer Hypoxie

Abstract

Der „Hypoxia Inducible Factor 1 (Hif1)“, bestehend aus den Proteinuntereinheiten Hif1alpha (Hif1a) und Hif1beta (Hif1b), ist ein DNA-Transkriptionsfaktorkomplex. Wird der Organismus bestimmten Belastungen wie zum Beispiel Hypoxie ausgesetzt, so vermittelt Hif1 zelluläre Anpassungsreaktionen basierend auf der Induktion spezifischer Gene. Zu nennen sind hierbei vor allem die Umstellung von aerober auf anaerobe Glykolyse und eine Verbesserung der Durchblutung und des Sauerstoffangebots (Induktion von VEGF und EPO). Bisher wurde Hif1 vor allem auf posttranskriptioneller Ebene untersucht, wobei man lediglich für die alpha-Proteinuntereinheit sauerstoffabhängige Regulation nachweisen konnte. Verschiedene Arbeiten auf transkriptioneller Ebene zeigen darüber hinaus differentielle Expression von Hif1a mRNA (jedoch ohne dabei spezifische Sequenzbereiche zu nennen). Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind zum Teil sehr widersprüchlich. Festzuhalten ist, daß von Hif1a mRNA mehrere strukturell unterschiedliche und auch gewebsspezifische Varianten bekannt sind, deren Expressionsverhalten, Funktion und Bedeutung weitgehend unklar ist. Ebenfalls sind bereits Antisense Varianten von Hif1a beschrieben worden, welche man in Bezug auf RNA-RNA-Interaktion nicht außer Acht lassen darf. In dieser Arbeit wurde nach der Existenz neuer, noch nicht charakterisierter mRNA-Varianten von Hif1a gesucht. Die neuen Varianten und die bereits bekannten Referenz mRNA-Varianten von Hif1a wurden nachfolgend auf Ihre Expression und insbesondere auf ihre Induzierbarkeit in vitro und in vivo untersucht. Hierdurch erhofften wir uns einen ersten Beitrag zur Aufklärung der bis dahin bestandenen Widersprüchlichkeiten bezüglich der transkriptionellen Regulation von Hif1a zu leisten. Dazu wurden zunächst neue mRNA-Kandidaten von Hif1a durch Datenbankanalysen der Expressed Sequence Tags (ESTs) im Bereich des Hif1a Gens, der phylogenetischen Konservierung der jeweiligen ESTs, sowie des phylogenetischen Abgleichs der Referenz mRNA-Sequenzen ermittelt. Die Expression der Kandidaten und der Referenzsequenzen wurde nach Zellaufreinigung und Probenisolation mittels Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), 3’ Rapid Amplification of cDNA Ends (3’RACE) und quantitativer Real-Time RT-PCR in verschiedenen Geweben und Zelllinien untersucht. Bestätigte Kandidaten-ESTs wurden sequenziert und anschließend in Zelllinien in vitro, und in aus Probanden gewonnenen PBMCs in vivo, auf ihre differentielle Regulierung hin untersucht. Als Ergebnis des phylogenetischen Hif1a EST und mRNA Referenz-Sequenz-Abgleichs, wurde beim Menschen ein längeres 3´UTR als bisher beschrieben gefunden. In diesem 2000 Basenpaare weiter downstream des bisher angenommenen 3´UTR-Endes von Hif1a liegenden Kandidaten „Hif1a-long variant“ (Hif1a-lv) fand sich ein hoch konserviertes Polyadenylierungssignal. Nach geeigneter Primerwahl konnte Hif1a-lv in verschiedensten Gewebearten und Zelllinien in vitro mittels 3´RACE und nachfolgender Sequenzierung des Produkts als polyadenyliertes EST nachgewiesen werden. Im Rahmen der in vitro Untersuchung von Hif1a-lv und den konventionellen Hif1a mRNA-Varianten in Kobaltchlorid behandelten Myotuben, fand man heraus, dass lediglich Hif1a-lv mit einem Expressionsanstieg auf induzierte Hypoxie reagiert. Dieses differentielle Expressionsverhalten zeigte sich auch in vivo bei einem Halbmarathonwettkampf, nicht jedoch beim Versuch der Belastung durch normobare Hypoxieexposition, wo alle gemessenen Sequenzbereiche nicht signifikant in ihrem Expressionsverlauf waren. Bei Lokalisationsbestimmungen nach Zellfraktionierung wurde Hif1a-lv überwiegend im Zellkern nachgewiesen, während man die konventionellen Hif1a mRNA-Varianten vor allem im Zytoplasma vorfand. Mittels RT-PCR konnte schließlich eine Konnektion von Hif1a-lv mit dem Exon 14 und somit mit der Referenz mRNA von Hif1a mRNA aufgezeigt werden. Auf Grund einer bisher fehlenden Promotorregion kann Hif1a-lv momentan nicht als mRNA-Normvariante von Hif1a bezeichnet werden. Die phylogenetisch hoch konservierte Polyadenylierungsstelle, die ubiquitäre Expression und die von Hif1a unterschiedliche, unabhängige, differentielle Regulation sprechen jedoch für eine funktionelle Besonderheit des Polyadenylierten ESTs Hif1a-lv. Dabei ist nicht klar ob Hif1a-lv ausschließlich in Akutsituationen oder überhaupt für das gleiche Protein kodiert, wie die konventionellen Hif1a mRNA-Varianten, oder ob es eventuell nur ein Regulationstool der Zelle zur Prozesssteuerung darstellt. Verantwortlich für die Zellkernretention von Hif1a-lv könnte eine Loopbildung innerhalb des 3´UTR sein, wofür in dieser Arbeit Anzeichen gefunden wurden. Um in Zukunft Forschungsergebnisse besser interpretieren und vergleichen zu können, sollten beim Messen von Hif1a mRNA die dabei verwendeten Primer und damit die geprimten Sequenzbereiche genau angeben werden. Auch macht es in unseren Augen keinen Sinn sich bei Messungen von Hif1a auf nur eine mRNA-Variante zu beziehen. Ebenfalls sollten in Zukunft weitere Untersuchungen bezüglich der Bedeutung und Funktion der verschiedenen Hif1a mRNA-Varianten angestrengt werden, sowie methodische Probleme bei der Detektion mittels PCR (RNA-RNA Interaktion und komplexe RNA-Strukturen betreffend) gelöst werden.

"Hypoxia Inducible Factor 1“ (Hif1) is a DNA transcription factor complex, consisting of the protein subunits Hif1alpha (Hif1a) and Hif1beta (Hif1b). If the organism is exposed to certain stress such as hypoxia, Hif1 provides cellular adaptation based on the induction of specific genes. These especially include the switch from aerobic to anaerobic glycolysis and the improvement of the blood flow and oxygen supply (induction of VEGF and EPO). Until now, the regulation of Hif1 was studied on a post-transcriptional level primarily and only for the alpha-subunit an oxygen-dependent regulation has been shown. Some studies additionally showed differential expression of Hif1a mRNA, but did not take transcriptional diversity of Hif1a into account. The results of these studies are often contradictory. It should be noted that several different alternative splice variants of Hif1a mRNA including some tissue specific variants are known, but their differential regulation of expression and their functional significance is largely unclear. Also there are already antisense variants of Hif1a described, which can not be ignored in terms of RNA-RNA interaction. In this study we investigated whether novel, not yet characterized mRNA variants of Hif1a exist. New variants and already known reference mRNA variants of Hif1a were analyzed concerning their differential expression in vitro and in vivo. Thus we hoped to make a first contribution to the elucidation of the hitherto existing contrariness regarding the transcriptional regulation Hif1a. First of all potential mRNA candidates of Hif1a were ascertained by database analysis of Expressed Sequence Tags (ESTs) at the locus of the Hif1a gene including analysis of the phylogenetic conservation of the ESTs and reference mRNA sequences. After cell purification and sample isolating the expression of the mRNA candidates and the reference sequences was investigated by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), 3' Rapid Amplification of cDNA Ends (3'RACE) and quantitative real-time RT-PCR in different tissues and cell lines. Confirmed candidate ESTs were sequenced and their differential expression was studied in cell lines in vitro and in PBMCs obtained from test persons in vivo. As a result of the phylogenetic Hif1a EST and mRNA reference sequence alignment, a potential variant with a 2000 bp longer 3' UTR than previously described was found for humans. This candidate „Hif1a-long variant“ (Hif1a-lv), holds a highly conserved polyadenylation signal. After choosing appropriate primers, Hif1a-lv could be detected and verified as a polyadenylated EST in different tissues and cell types in vitro by using 3' RACE and subsequent sequencing of the product. In an in vitro study of Hif1a-lv compared with conventional Hif1a mRNA variants in myotubes, we only found differential up-regulation of Hif1a-lv in response to hypoxia induced by treatment with cobalt chloride. Exclusive differential up-regulation of Hif1a-lv could also be found in vivo in a half marathon race, but not in experiments with exposure to normobaric hypoxia, where all measured sequences did not show differential regulation. In experiments concerning the cellular localization after cell fractionation, Hif1a-lv could be detected predominantly in the cell-nucleus, while the conventional Hif1a mRNA variants mainly were localized in the cytoplasm. By a long range RT-PCR we finally verified a connection of the Hif1a-lv sequence part with the exon 14 and thus with the reference mRNA region of Hif1a mRNA. Due to a not yet known affiliation of Hif1a-lv to a promoter region, Hif1a-lv can currently not be described as an mRNA norm-variant of Hif1a. However the phylogenetically highly conserved polyadenylated area, the ubiquitous expression and the independent, differential regulation compared to Hif1a, are indicative for a functional role of the polyadenylated EST Hif1a-lv. However, it is not clear whether Hif1a-lv is soley differentially expressed in acute situations, whether it is translated at all into a protein as the conventional Hif1a mRNA variants, or whether it might be a regulation tool of the cell for process control. With regard to the latter, we found signs of loop-building within the 3' UTR of Hif1a-lv in this dissertation that could be responsible for the retention in the cell-nucleus. To be able to interpret and compare the results of upcoming research studies in a better way, used primers and measured sequences of Hif1a mRNA should be mentioned specifically. In our opinion it also does not make sense to refer to only one variant of Hif1a mRNA in expression studies. Further studies should be made that try to clarify the meaning and function of the various Hif1a mRNA variants and cope with the methodological problems of the PCR-detection (RNA-RNA interaction and complex RNA structures).