Charakterisierung antileukämischer NK-Zell-Klone von gesunden Spendern und Patienten nach allogener Stammzelltransplantation

Abstract

Das Rezidiv der malignen Grunderkrankung ist nach wie vor die wichtigste Komplikation nach allogener Stammzelltransplantation (SZT). Die Effektivität und klinische Relevanz von NK-Zell-vermittelter Zytotoxizität gegenüber Blasten lymphatischer Leukämien wird diesbezüglich kontrovers diskutiert. Bei dieser Arbeit wurde ein Protokoll etabliert zur effizienten Klonierung von NK-Zellen durch CD3-Depletion mit MACS-Technik und Kultivierung mit IL-2, IL-15 und bestrahlten PMNC (periphere mononukleäre Zellen) als Feederzellen. Eine Expansion der NK-Klone war über das 4x106-fache möglich und erlaubte die funktionelle Untersuchung mittels BATDA-Zytotoxizitätstests gegenüber kryokonservierten kindlichen Prä-B-ALL Blasten und Referenzzelllinien sowie die immunphänotypische Charakterisierung durch FACS-Analyse. Die Untersuchung von über 400 NK-Klonen gesunder Spender sowie von Patienten nach SZT zeigte, dass ein großer Teil der Klone kryo-konservierte kindliche Prä-B-ALL Blasten effektiv lysieren konnte, wenn die HLA-Klasse I-Expression vermindert war. Blasten mit hoher HLA I-Expression waren keine empfindlichen Targets einer NK-Zell vermittelten Lyse. Das alloreaktive Verhalten der NK-Klone wurde reguliert durch die verschiedene Oberflächenexpression der drei wesentlichen inhibitorischen KIRs (Killer cell immunoglobulin-like receptors) CD158a, CD158b und CD158e. NK-Klone mit hoher Aktivität waren hauptsächlich dadurch gekennzeichnet, dass sie keinen der drei KIRs exprimierten oder nur einen KIR, welcher keinen korrelierenden HLA I-Liganden auf der Targetzelle binden konnte. Entsprechend zeigte sich bei NK-Klonen mit Expression von einem oder mehreren KIRs mit HLA I-Ligand auf den Targetzellen eine zunehmende Inhibition der Zytotoxizität. Der Einfluss des KIR-Expressionsmusters auf die antileukämische Aktivität war zum einen unabhängig vom HLA-C-Typ der NK-Zellen und nahm zum anderen gegenüber Targetzellen mit hoher HLA I-Expression an Bedeutung ab. Zusammenfassend belegen die Ergebnisse dieser Arbeit auf klonaler Ebene das Vorkommen antileukämischer NK-Zellen gegenüber kindlichen Prä-B-ALL Blasten und weisen darauf hin, dass das KIR-Expressionsmuster Einfluss auf deren lytische Aktivität nimmt und eine Vorhersage für alloreaktives Verhalten ermöglicht.

Replase remains a major complication after allogeneic stem cell transplantation in malign diseases. The clinical relevance of natural killer (NK)-cell mediated cytotoxic activity versus blasts of lymphatic leukemias is discussed controversely. In this study we established a protocol to generate efficiently NK-clones by using CD3-depletion with MACS and expand them by culturing with IL-2, IL-15 and radiated feeder cells. The NK-clones were testet with BATDA-cytotoxicity assays versus kryo-conserved prediatric B-lineage leukemic blasts and reference cell lines. The expression of killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) was analysed by FACS. In more than 400 NK-clones from healthy donors and pediatric patients after stem cell transplantation a majority of clones could lyse kryo-conserved pediatric B-lineage leukemic blasts effectively, when HLA class I expression on the blasts was reduced. Blasts with high expression of HLA class I molecules were not susceptible to NK-cell mediated lysis. Alloreactivity of NK-clones was influenced by the expression of the three major KIRs CD158a, CD158b und CD158e. Clones with high antileukemic activity were mainly characterized by not expressing any of the three KIRs or only a single KIR without corresponding ligand on the target cells. Accordingly we could observe an increasing inhibition of antileukemic activity in NK-clones expressing one or more KIRs with corresponding ligands on target cells. The significance of KIR-ligand-mismatch was reduced in target cells with high expression of HLA class I molecules. In summary this study showed on a clonal level the existence of antileukemic NK-cells versus pediatric precursor B-ALL blasts and indicates that the pattern of KIR expression on NK-cells as well as the HLA-expression on target cells are major factors to identify patients who could benefit from NK-mediated graft-versus-leukemia effects after mismatched stem cell transplantation.