Entwicklung serologisch geeigneter Schwingquarz-Beschichtungen für die Blutgruppenanalyse mit Biosensor

Abstract

Einleitung: Fortschritte in der Behandlung verschiedenster Krankheiten und Notfälle führen zu einem stetig gewachsenen und raschen Bedarf an Blutprodukten in der stationären und ambulanten Krankenversorgung. Eine adäquate Blutgruppenanalyse ist seit Einführung der Bluttransfusion unerlässlich (2, 5). Die derzeit in der klinischen Routine verwendeten Testverfahren basieren nahezu vollständig auf dem Prinzip der optischen, beziehungsweise visuell beurteilten Agglutination. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Optimierung biologischer Schichtsysteme zur Blutgruppenanalyse mit Schwingquarzen als Biosensoren.

Material/Methoden: Speziell geschnittene, goldbedampfte Schwingquarze wurden mit Protein A belegt um eine gerichtete Antikörperbeschichtung zu ermöglichen(3, 4). Mittels in der klinischen Routine etablierter, blutgruppenspezifischer Antikörper vom Typ IgG und IgM wurden in verschiedenen Beschichtungsvarianten das Anbindungsverhalten auf dem Quarz untersucht. Die Blutgruppenanalyse erfolgte im AB0, Rhesus- (Rh), Duffy- (Fy) und Kell- (K) Blutgruppensystem. Als Negativprobe dienten Erythrozyten, die nicht Träger des zu detektierenden Merkmals waren. Die Wiederverwendbarkeit der Quarze wurde durch chemische Regeneration mit Natronlauge und Dieethyläther untersucht. Die Ankopplungsversuche wurden zunächst in einem Dummysystem durchgeführt und vorläufig optisch quantifiziert. Vorgetestete Schichtsysteme wurden exemplarisch in der Fließinjektionsanlage (FIA) untersucht.

Ergebnisse: Belegungsdichte (BD) auf dem Schwingquarz in Zellen/mm²: A: 20000+/-0, Rh D: 20000 +/-0, Rh Dweak: 13280 +/-438, Rh c: 4260 +/-487, Rh C: 6000 +/-374, Rh e: 12240 +/-654, Rh E: 20000+/-0, K: 7980 +/-148, Fy: 2020 +/-109. Die BD im Rh-System konnte durch vorausgegangene Enzymbehandlung signifikant gesteigert werden (p<0,05). Inkubierte Erythrozyten konnten nur in geringer Anzahl immobilisiert werden, teilweise kam es zu Agglutinationen. Die chemische Regeneration erforderte eine Neubeschichtung. Die Messung in der FIA zeigte für die getesteten Blutgruppen einen Frequenzabfall bis 475 Hz. Diskussion: Eine spezifische Ankopplung von Erythrozyten konnte bei allen getesteten Blutgruppensystemen erreicht werden. Die chemische Regeneration hat sich als geeignetes Verfahren zur Wiederverwertung herausgestellt. Aufgrund der aufwendigen Neubeschichtung sollte auch die oberflächlich Absprengung als physikalisches Verfahren in Betracht gezogen werden (1). Der Frequenzabfall in der FIA bestätigt die serologische Eignung von Schwingquarzen für die Blutgruppenanalyse.

Schlussfolgerung: Die biosensorische Blutgruppenanalyse mit Schwingquarzen stellt für die moderne Transfusionsmedizin ein schnelles und zuverlässiges Verfahren dar, welches keine optische Agglutinationsbeurteilung erfordert. Dennoch wird die parallele optische Auswertung ihre wichtige Rolle als Vergleichskriterium bei der Weiterentwicklung der Technologie zunächst beibehalten.

1. Cluss S. 2006. Bestimmung optimaler Parameter und Reaktionsbedingungen von Schwingquarzen zur Messung einer blutgruppenspezifischen Ankopplung von Erythrozyten. Dissertation, Universität Tübingen 2. Eckstein R. 2001. Immunhämatologie und Transfusionsmedizin. München. Urban und Fischer Verlag pp. 3. Gehring FK. 2005. Schwingquarzsensorik in Flüssigkeiten. Dissertation, Universität Tübingen 4. Harlow E, Lane D, . 1988. Antibodies - A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory 5. Issit P., Anzee D. 1998. Applied Blood Group Serology. Durham: Montgomery Scientific Publications

Purpose: Advances in treatment of a multitude of diseases and emergencies lead to a constantly increased and rapid demand of blood products in in- and outpatient health care. Adequate blood group typing is indispensable since inauguration of blood transfusions(2, 5). Presently applied test procedures are almost completely based on the principle of optical, respectively visual assessed agglutination. Aim of the study was to develop and optimize biological film systems for blood group typing with oscillating crystals as biosensor.

Materials/Methods: Particular sliced, gold-metallized crystals were coated with Protein A in order to facilitate a straightened antibody-film (3, 4). Using in clinical routine well-established, blood group specific antibodies Type IgG and IgM, varying coatings were examined regarding connection characteristics on the quartz. Blood group analysis was performed in AB0-, Rhesus- (Rh), Duffy- (Fy) und Kell- (K) system. Erythrocytes that are not carrying the quested property served as negative pattern. Reusability of the quartzes was investigated by regeneration with sodium hydroxide and diethyl ether. Initially connection-trials were performed in a Dummy-system and preliminary optically quantified. Pretested film systems were exemplarily checked in the flow-injection facility (FIF).

Results: Specific connection of erythrocytes was achieved with all tested blood group systems. Occupancy density (OD) in Cells/mm²: A: 20000+/-0, Rh D: 20000+/-0, Rh Dweak: 13280 +/-438, Rh c: 4260 +/-487, Rh C: 6000 +/-374, Rh e: 12240 +/-654, Rh E: 20000 +/-0, K: 7980 +/-148, Fy: 2020+/-109. OD in the Rh-System could be significantly enhanced by prior enzyme treatment (p<0.05). Incubated erythrocytes were immobilized only in marginal quantity. Partially, there was agglutination. Chemical regeneration required recoating. The measurements in the FIF disclosed frequency decay up to 475 Hz.

Discussion: A specific connection of erythrocytes was attained with all tested blood group systems. Chemical regeneration has turned out to be an appropriate procedure. Due to elaborate recoating procedures, superficial shot as a physical method should be considered (1). The frequency decay in the FIF confirmed the serological adequacy of oscillating crystals for blood group typing.

Conclusion: Biosensory blood group analysis with oscillating crystals depicts for the modern transfusion medicine a rapid and reliable method that is not depending on optical assessment of agglutination. However, parallel optical evaluation will initially maintain its important role as comparative criterion in the development of this new technology.

1. Cluss S. 2006. Bestimmung optimaler Parameter und Reaktionsbedingungen von Schwingquarzen zur Messung einer blutgruppenspezifischen Ankopplung von Erythrozyten. Dissertation, Universität Tübingen 2. Eckstein R. 2001. Immunhämatologie und Transfusionsmedizin. München. Urban und Fischer Verlag pp. 3. Gehring FK. 2005. Schwingquarzsensorik in Flüssigkeiten. Dissertation, Universität Tübingen 4. Harlow E, Lane D, . 1988. Antibodies - A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory 5. Issit P., Anzee D. 1998. Applied Blood Group Serology. Durham: Montgomery Scientific Publications