Endothelial Catabolism of Extracellular Adenosine during Hypoxia: Role of Surface Adenosine Deaminase and CD26

Abstract

It is well known that extracellular levels of adenosine increase during limited oxygen availability. Acute increases of adenosine concentration are important to diminish excessive inflammation or vascular leakage in hypoxic tissue. Chronically elevated adenosine levels reveal toxic effects. Based on these facts, there must be clearance mechanisms which inhibit high adenosine concentrations during long-term hypoxic conditions. Previous microarray analysis revealed a nearly 50-fold induction of the enzyme adenosine deaminase (ADA) mRNA in hypoxia which metabolizes adenosine to inosine. Guided by these results the following investigations were done. First studies were done by real-time PCR and western blot. These findings confirmed the initial microarray results. The ADA mRNA was prominently induced by hypoxia and also the western blot analysis of total ADA protein indicated a time - dependent induction of ADA. Measurements of enzyme activity revealed in lysates as well as in supernatant and on cell surface hypoxia – dependent increases of ADA activity. Moreover, further examinations in human endothelia showed that the ADA – complexing protein CD26 is also induced by hypoxia. Furthermore ADA activity on cell surface was dependent on CD26 binding to ADA. Treatment with glycoprotein HIV-1 gp120, a specific inhibitor of ADA – CD26 interaction, showed an effective blocking of inosine generation. Functional studies in in vitro as well as in in vivo models revealed that inhibition of ADA with deoxycoformycin enhances protective responses mediated by adenosine (e.g. vascular leak, neutrophil accumulation or pumonary edema). Altogether these findings reveal induction of ADA as an innate metabolism during conditions of limited oxygen supply to decrease elevated extracellular adenosine levels by converting adenosine to inosine and to protect in this way the organism from potentially deleterious effects of long-term increase of adenosine. In contrast, during acute hypoxia associated with excessive inflammation and vascular leakage, inhibtion of ADA may serve as a new therapeutic strategy to enhance adenosine signaling in endothelia and inhibit tissue permeability and accumulation of inflammatory cells.

Es ist bekannt, dass sich Adenosin, ein Abbauprodukt des Adenosintriphosphats (ATP), unter hypoxischen Bedingungen im extrazellulären Raum anreichert. Ein kurzfristiger Anstieg der Adenosinkonzentrationen im hypoxischen Gewebe hat einen positiven Effekt, da es die Ausbreitung der Entzündungsreaktion sowie die Endothelschädigung im Rahmen des Sauerstoffmangels reduziert. Über längere Zeit hinweg bestehende erhöhte Adenosinkonzentrationen zeigen hingegen toxische Wirkung. Aufgrund dieser Tatsachen war anzunehmen, dass es einen Mechanismus im Stoffwechsel gibt, der die Anhäufung von Adenosin unter längerandauerenden hypoxischen Bedingungen verhindert. Vorbestehende Untersuchungen mittels Microarray-Analyse zeigten eine nahezu 50-fach gesteigerte Induktion des Enzyms Adenosindeaminase (ADA) unter Hypoxie, welches Adenosin zu Inosin abbaut. Diese Ergebnisse waren somit Grundlage dieser Arbeit. Die weiteren Untersuchungen mittels real-time PCR und Western blot bestätigten die ersten Ergebnisse. Eine Induktion der Adenosindeaminase konnte sowohl auf mRNA-Ebene, Protein-Ebene als auch bei den funktionellen Messungen der ADA - Aktivität im Zelllysat, im Überstand als auch auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Weitere Experimente zeigten ebenso eine Hypoxie-bedingte Induktion von CD26. Es konnte gezeigt werden, dass ADA auf der Zelloberfläche nur in Verbindung mit CD26 enzymatisch aktiv ist. Durch Hemmung des ADA - CD26 – Komplexes mit dem Glykoprotein HIV-1 gp120, einem spezifischen Inhibitor, konnte die Inosinentstehung fast vollständig gehemmt werden. Bei weiterführenden Untersuchungen zeigte sich sowohl im in vitro als auch im in vivo Modell, dass durch eine spezifische Hemmung des Enzyms ADA mittels Deoxycoformycin die protektive Wirkung des Adenosins auf die Zellwandpermeabilität verstärkt werden konnte. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse einen angeborenen Metabolismus, der unter hypoxischen Bedingungen zu einer Induktion der Adenosindeaminase führt, um die toxischen Wirkungen bei chronisch erhöhten Adenosinkonzentrationen durch Abbau zu Inosin zu verringern. Im Gegensatz dazu könnte bei akut aufgetretener Hypoxie die Hemmung der Adenosindeaminase ein möglicher therapeutischer Ansatz sein, um die Endothelschädigung als auch die Entzündungsreaktion im hypoxischen Gewebe zu mindern.