Expression des axonalen Lenkungsmoleküls Netrin-1 und seines Rezeptors DCC im humanen fetalen Telencephalon

Abstract

Das primär als axonales Lenkungsmolekül beschriebene Netrin-1 und dessen Rezeptor DCC können im sich entwickelnden fetalen ZNS multimodale Funktionen ausüben. Sie lenken aussprossende Nervenfasern - als einziges aller Lenkungsmoleküle - durch eine attraktive Wirkung, lotsen migrierende Vorläuferzellen aus der Tiefe der Keimzonen zum jeweiligen Bestimmungsort im Kortex oder in subkortikal gelegene Kerngebiete. Darüber hinaus schützen sie via der so genannten „dependence“-Rezeptor-Funktion Zellen vor Apoptose. Dies geschieht dadurch, dass eine DCC exprimierende Zelle in Netrin-1-reichem Milieu vor Apoptose geschützt ist, wohingegen bei Abwesenheit des Liganden Netrin-1 ein bislang noch nicht komplett verstandener Apoptosepfad eingeleitet wird. Netrin-1 zeigt ferner eine proangiogene Wirkung auf fetale Endothelien, wobei hier die Rolle des DCC-Rezeptors noch ungewiss ist. Die vorliegende Studie wurde an 21 menschlichen, fetalen Großhirnen unterschiedlichen Alters durchgeführt, die keine neuropathologischen Alterationen der Entwicklung zeigten. Ergänzend wurde dazu das Expressionsverhalten von DCC und Netrin-1 im nicht-fetalen Großhirn, mit Fokus auf Expressionsverhalten in Neuronen der Rinde und im Mark an 23, als adulte Normalgehirne definierte Gewebeproben untersucht. Zunächst wurden nur die fetalen Gewebeproben mit einem Antikörper gegen das Ki-67-Antigen (Proliferationsmarker) zur Ermittlung der fetalen Proliferationgebiete immunhistochemisch gefärbt. Die Untersuchung des Expressionsverhaltens für Netrin-1 und DCC erfolgte ebenfalls mittels Immunhistochemie an den fetalen und adulten Gewebeproben. Die Auswertung erfolgte dabei anhand eines histologischen Scores. Als proliferativ aktivste Gebiete der fetalen Rindenschichten konnten die Ventrikulärzone, Subventrikulärzone und die Intermediärzone ausgemacht werden, die mit zunehmendem Alter der Feten ihre proliferative Aktivität signifikant reduzierten. Im Ganglienhügel zeigte sich die höchste Proliferationsrate aller beurteilten fetalen Großhirnbezirke, wobei sich mit zunehmendem Alter keine Regression des Expressionsverhaltens darbot. Gerade diese Proliferationsbereiche des fetalen Großhirns (abgesehen von der Intermediärzone) zeigten keine signifikanten Unterschiede im Expressionsverhalten für DCC und Netrin-1, mit jeweils sehr hohen Expressionsraten. Die Rindenplatte imponierte für DCC als auch für Netrin-1 als Ort mit sehr starker Expression ohne Nachweis einer Regression mit zunehmendem Alter. Im Striatum, als Beispiel für subkortikal gelegene Neuronengruppen, konnten ebenso beide Moleküle nachgewiesen werden, wobei die DCC-Expression mit zunehmendem Alter der Feten rückläufig war. Präformierte fetale Gefäße zeigten eine sehr starke Netrin-1-Expression in Endothelien, jedoch eine schwache DCC-Expression. Darüber hinaus konnten sowohl im Ependym, als auch im Plexus choroideus der Seitenventrikel starke proliferative Aktivität und Netrin-1- und DCC-Expression detektiert werden. Als eindrücklich zeigte sich das Färbeverhalten von insbesondere Netrin-1 in der Inneren Kapsel, wo sich Netrin-1 und DCC im Faserverlauf visualisieren ließen. In den adulten Gehirnen konnten DCC und Netrin-1 ohne Regression mit zunehmendem Alter sowohl in Neuronen der Rinde, als auch im Mark nachgewiesen werden. Die Netrin-1-Expression lag in der Rinde signifikant höher als im Mark. DCC und Netrin-1 konnten in allen beurteilten fetalen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden, so dass davon ausgegangen werden muss, dass sie über die gesamte Reifungsperiode an der strukturellen Organisation des Großhirns beteiligt sind. Die heterogene Verteilung von Netrin-1 und DCC suggeriert eine regional unterschiedliche Funktion im fetalen Großhirn. Möglicherweise üben sie in den Keimzonen, in Neuronenverbänden der Rindeplatte und des Striatums, sowie in Plexus und Ependym einen Apoptoseschutz aus. Dem selben Mechanismus folgend könnten auch radiale Gliazellen vor Apoptose geschützt werden, so dass das strukturelle Migrationsgerüst gewahrt bleibt. Präformierte fetale Gefäße exprimieren kaum DCC, so dass hier weiter über die Rolle des Ligand-Rezeptor-Paares diskutiert werden muss. Die hohen Expressionsraten für Netrin-1 in der Rindenplatte und in der Subventrikulärzone können durch die attraktive Wirkung auf aussprossende Gefäße eine ausreichende Vaskularisierung und somit eine Garantie von Substratzu- und -abfuhr für diese sensiblen Regionen gewährleisten. Die starke Anwesenheit von DCC und besonders von Netrin-1 in der Inneren Kapsel deutet auf ein Lenkungsvermögen hin, dass gerade an Knotenpunkten die Richtung auswachsender Fasern reguliert. Der Nachweis von Netrin-1 und DCC im sich entwickelnden menschlichen Telencephalon unter Berücksichtigung der regionalen Verteilung lässt den Stellenwert dieser beiden Proteine für die physiologische Entwicklung des fetalen Großhirns erkennen.

The axonal attractant netrin-1 and its receptor DCC, are also described as putative anti-apoptotic, migratory and angiogenic factors during fetal development. Little is known about the distribution of those molecules in human fetal central nervous system development. We investigated 21 human fetal telencephalic (age: 12th-28th week of gestation) and 23, as normal human adult brain defined, formaline fixed and paraffin embedded specimens by means of immunohistochemistry with antibodies against netrin-1 and the DCC-receptor. For detection of proliferative areas we also accomplished immunohistochemistry with an antibody against the Ki-67-protein. A semiquantitative score for staining intensity and frequency was applied for the neocortical fetal layers and the striatal neurons, as well as endothelial cells of preformed vessels and ependymal and choroid plexus cells. In the case of the normal adult brain specimens we looked at differential immunoreactivity of the white matter and the cortex. Among others we saw highest impacts of netrin-1 and DCC in the germinal layers and the ganglionic eminence. The cortical plate also impressed with high scoring for both, without any Ki-67-expression. Almost all endothelial cells showed massive netrin-1-expression with hardly any DCC-immunoreactivity. Selective strong expression of netrin-1 in the internal capsule could be detected and probably reflects a specific upregulation in CNS areas, where considerable directional changes in axonal growth are necessary. The detection of both, netrin-1 and DCC in normal adult brain rises the question of probable function and regulation in adult brain. Our data suggests a possible role for netrin-1 and DCC as lifeguards for proliferating cells in the germinal layers, neuronal cells of the cortical plate, subcortical neurons and cells of the choroid plexus and ependyma. The specific distribution in fetal telencephalic layering makes us suggesting DCC and netrin-1 as candidate factors for neuronal migration. Upregulation of netrin-1 on endothelial cells with suppressed DCC expression induces angiogenesis via another probable pathway with subsidiary DCC action. The immunohistochemical detection of DCC and netrin-1 in human fetal telencephalic development and the regional distribution pattern underlines the importance of their physiologic function in human central nervous system development.