Effizienzsteigerung der therapeutischen Suizidgentherapie durch Kopplung mit Zellpermeabilität-vermittelnden Motiven

Abstract

Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist einer der am häufigsten auftretenden malignen Tumoren weltweit. Trotz des wissenschaftlichen Fortschrittes in der Erforschung der Ätiologie und der Risikofaktoren konnte das Überleben der Patienten in den letzten Jahren nicht wesentlich verbessert werden. Deshalb ist es von großer Wichtigkeit, neue Therapiestrategien zu erforschen. Eine dieser Strategien stellt die Suizidgentherapie dar. Sie beruht auf einer selektiven Abtötung der Tumorzellen durch Erzeugung toxischer Metabolite aus einer nicht toxischen Prodrug, wie z.B. 5-Fluorcytosin (5-FC). Die Metabolisierung dieser Prodrug geschieht über Enzyme, für die sog. Suizidgene kodieren. Das hier verwendete Suizidgen stellt eine Fusion aus der Cytosindesaminase aus Saccharomyces cerevisae (YCD = Yeast CD) und der nachgeschalteten Yeast uracil phosphoribosyltransferase (YUPRT) dar. Dieses Fusionsgen wird Super-Cytosindesaminase (SCD = SuperCD) genannt. Suizidgene werden über virale und nicht virale Vektoren an ihren Wirkort, die Tumorzellen, transportiert. Eine Barriere dieses Verfahrens ist die mäßige Transduktionseffizienz, die allerdings potenziell durch eine Verknüpfung des Suizidgens an ein Zellpermeabilität-vermittelndes Motiv überwunden werden kann. Zellpermeabilität-vermittelnde Motive entsprechen verschiedenen Peptiden und Proteinen, welche die Eigenschaft besitzen, zelluläre Membranen zu durchdringen und so in das Innere der Zellen zu gelangen. Mittels dieser Motive können an sie gekoppelte Ladungsmoleküle ins Cytoplasma und/oder in den Zellkern von Tumorzellen eingeschleust werden. Dieser Vorgang wird auch Spread genannt. Zwei dieser Motive wurden in der vorliegenden Arbeit getestet: das Translocation Motif (TLM) aus dem Hepatitis B Virus und das VP22-Protein aus Herpes simplex Virus Typ-1. Die Zielsetzung bestand in einem bisher noch nicht erfolgten Effizienzvergleich der Kopplungsverfahren des Fusionsproteins SCD mit Zellpermeabilität-vermittelnden Motiven gegenüber der Therapie mit nicht-fusioniertem SCD Suizidgenprotein alleine. Auf dieser Grundlage soll es ermöglicht werden, eine Vorauswahl für den angestrebten klinischen Einsatz der Fusionsproteine TLM-SCD, SCD-TLM, VP22-SCD und SCD-VP22 als potenziell verbesserte Suizidgentherapeutika zu treffen. Dazu wurden adenovirale Vektoren mit den entsprechenden Fusionsgenen generiert und deren Expression durch Westernblot-Analysen nachgewiesen. In einem weiteren Schritt gelang der Beweis des interzellulären Transports (Spread) der VP22-Fusionsproteine durch direkte und indirekte Immunfluoreszenzverfahren. Die Testung des TLM-vermittelten Transports gelang aus Mangel an kommerziell verfügbaren Antikörpern nicht. Schließlich fand der Effizienznachweis mittels SRB-Cytotoxizitätsassays statt. Unter Inkubation mit der Prodrug 5-FC konnten die Abtötungseffekte der einzelnen Fusionsproteine gegen die Infektion mit dem Suizidgen alleine verglichen werden. Für TLM-Fusionsproteine konnte keine Steigerung der Cytotoxizität gezeigt werden, VP22-Fusionsproteine dagegen konnten das Absterben der Zellen enorm verstärken. Das N-terminal verknüpfte VP22-SCD Fusionsprotein präsentierte dabei den größten Effekt. Damit stellen VP22-Fusionsproteine wichtige Werkzeuge der Suizidgentherapie dar und bedürfen der weiteren Erforschung.

The hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors worldwide. Despite the improvements in scientific research on etiology and risk factors, the survival of patients in recent years has not significantly improved. It is therefore of great importance to explore new therapeutic strategies. One of these strategies is the suicide gene therapy. It is based on a selective destruction of tumor cells through the production of toxic metabolites from a non-toxic prodrug, such as 5-fluorocytosin (5-FC). Special enzymes metabolize these prodrugs. So-called suicide genes encode for the enzymes. The gene used in the study is a fusion of the cytosine deaminase of Saccharomyces cerevisae (YCD = yeast CD) and the downstream yeast uracil phosphoribosyltransferase (YUPRT), which is called Super cytosine deaminase (SCD = SuperCD). Suicide genes are transported by viral and non-viral vectors into the tumor cells. A limitation of this method is the sub-optimal efficiency of transduction. This should be improved by using translocation motifs. Translocation motifs comply with peptides or proteins, which can penetrate cellular membranes and can get inside the target cells. In addition, these translocation motives can carry on coupled molecules into the cytoplasm and/or in the cell nucleus. This process is called spread. Here two of these motifs were tested: the translocation motif (TLM) from hepatitis-B virus (HBV) and the VP22 protein from herpes simplex virus type-1 (HSV-1). The goal of this study was to compare the efficiency of SCD coupled with translocation motifs versus SCD alone. Based on the results a better preselection of the fusion proteins for the intended clinical use should be possible. The fusion proteins TLM-SCD, SCD-TLM, SCD-VP22 and SCD-VP22 were tested as potentially improved therapeutic agents. As a result adenoviral vectors with the corresponding fusion genes were generated and their expression was detected by Western Blot analysis. In a further step the intercellular transport function (spread) of the VP22-fusion proteins was demonstrated through direct and indirect immunofluorescence microscopy analysis. The testing of the TLM-mediated transport failed because of lack of commercially available antibodies. Finally, SRB cytotoxicity assays were used for providing evidence of the efficiency tumor cell death treated with the different fusion proteins compared with SuperCD alone under incubation with the prodrug 5-FC. No increase of death for the protein TLM was discovered. In contrast, VP22-fusion proteins enhanced the death of tumor cells enormously. The N-terminal linked VP22-SCD showed the greatest effect. Thus, VP22-fusion proteins are important tools of suicide gene therapy and require further exploration.