Effekte von Rapamycin auf die Expression von Arteriosklerose- und Restenose- assoziierten Genen in humanen vaskulären glatten Muskelzellen

Abstract

Einleitung: Die Proliferation und Migration glatter Muskelzellen sowie Umbauvorgänge in der vaskulären extrazellulären Matrix spielen eine wichtige Rolle bei der Restenose nach perkutanen koronaren Interventionen mit Stentimplantation. Durch Stents die mit dem Makrolid Rapamycin (Sirolimus) beschichtet sind kann die In-Stent-Restenose verhindert werden. Rapamycin bindet hochspezifisch an die atypische Serin-Threonin-Kinase mTOR (mammalian target of rapamycin), wodurch die Aktivität von Zellzyklus-Inhibitoren erhöht und der Zellzyklus in der G1-Phase arretiert wird. Der genaue Wirkmechanismus ist jedoch bisher nicht aufgeklärt. Wir untersuchten den Einfluss von Rapamycin auf die Genexpression in humanen vaskulären glatten Muskelzellen. Material und Methoden: Humane arterielle glatte Muskelzellen wurden zunächst unter zwei unterschiedlichen Zellkulturbedingungen untersucht. 1) Kultivierung mit serumhaltigem Vollmedium bis zur Subkonfluenz gefolgt von Wachstumsarretierung unter serumfreien Bedingungen für 24h und anschließender Präinkubation mit Rapamycin 100nM in serumfreiem Medium für 6h. Dann folgte eine maximale Wachstumsstimulation mit Endothelzell-Medium (enthält insulin-like growth factor und fibroblast growth factor) für 6h unter Einwirkung von Rapamycin 100nM. 2) Kultivierung mit serumhaltigem Medium bis zur Subkonfluenz gefolgt von Inkubation der weiterhin proliferierenden Zellen mit Rapamycin 100nM in serumhaltigem Medium für 48h. Bei den Versuchen wurden jeweils Kontrollen ohne Rapamycin mitgeführt. Die aus den Zellen isolierte RNA wurde mittels Gene Arrays der Firma Affymetrix untersucht. Aufgrund der Ergebnisse in den Gene Arrays entschieden wir uns dazu, einige Hitzeschockproteine (HSP) mittels Western Blots und PCR weiter zu untersuchen. Wieder wurden Zellen mit serumhaltigem Medium bis zur Subkonfluenz inkubiert, anschließend für 24h im Wachstum arretiert und dann mit Rapamycin 100nM präinkubiert. Dann wurden die Zellen in Anwesenheit von Rapamycin 100nM in serumhaltigem Medium verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzt: Wachstumsstimulation mit Endothelzell-Medium, Einwirkung von H2O2, und Hitzeschock für 2h bei 40°C oder für 30min bei 42°C. Dabei wurden jeweils Kontrollen ohne Rapamycin auf die gleiche Weise behandelt. Diese Versuchsanordnung wurde mit gestaffelten Gesamt-Inkubationszeiten von 1,5h bis 48h durchgeführt. Aus den Zellen wurden die Proteine isoliert und Western Blots mit spezifischen Färbungen für HSP40, HSP70, HSP60 und HSP47 angefertigt, bzw. es wurde die RNA isoliert und eine Reverse Transkriptase-PCR mit spezifischen Primern für HSP70 durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion: In den Gene Arrays zeigte sich unter der Einwirkung von Rapamycin eine Hemmung der Expression von Hitzeschockproteinen in Versuchsanordnung 1), was aufgrund der beschriebenen Rolle dieser Proteine bei der Atherogenese von besonderer Bedeutung ist und einen plausiblen Wirkmechanismus von Rapamycin darstellt. In den weitergehenden Experimenten und Analysen mittels Western Blot und PCR zeigte sich, dass die Expression von Hitzeschockproteinen durch die genannten Stressfaktoren, vor allem durch Hitzeschock, gesteigert wird. Eine Hemmung dieser gesteigerten Expression durch Rapamycin zeigte sich in einigen Versuchen für HSP40 und HSP70. Insgesamt konnten die Ergebnisse jedoch nicht durchgängig reproduziert werden, sodass sie keine Aussage darüber zulassen, ob dies einen Wirkmechanismus von Rapamycin in humanen vaskulären glatten Muskelzellen darstellt. Die Ergebnisse der Gene Arrays zeigten ferner, dass Rapamycin bei kontinuierlicher Einwirkung auf serumstimulierte Zellen die Expression verschiedener EZM-Moleküle wie COMP/TSP-5 oder Kollagen VI reguliert. Auch die Steigerung der Expression von Bone morphogenetic protein 2 und 6 durch Rapamycin in den Gene Arrays ist eine bedeutsame Beobachtung, da diese Proteine mit der Kalzifikation von arteriosklerotischen Läsionen in Verbindung gebracht werden.

Introduction: The proliferation and migration of smooth muscle cells and remodeling processes in the extracellular matrix of blood vessels play an important role in the development of restenosis after percutaneous coronary interventions with stent implantation. Stents which are coated with the macrolide rapamycin (sirolimus) can prevent in-stent-restenosis. Rapamycin binds specifically to the atypical serine-threonine-kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) which leads to an increased activity of cell cycle inhibitors and cell-cycle arrest in the G1-phase. The precise mechanism is not known to date. We investigated the effects of rapamycin on gene expression in human vascular smooth muscle cells. Materials and Methods: Human arterial smooth muscle cells were first examined with two different patterns of cell culture: 1) Growth to subconfluence with serum-containing medium followed by growth arrest with serum-free medium for 24h followed and pre-incubation with rapamycin 100nM in serum-free medium. Then maximum stimulation of growth with endothelial cell medium (contains insulin-like growth factor and fibroblast growth factor) for 6h under the influence of rapamycin 100nM. 2) Growth to subconfluence with serum-containing medium followed by incubation of the proliferating cells with rapamycin 100nM in serum-containing medium for 48h. Controls were done for both patterns without rapamycin. The RNA isolated from these cells was investigated with Affymetrix gene arrays. The results from the gene arrays led to the decision to investigate further several heat shock proteins (HSP) with Western Blots and PCR. Again cells were incubated with serum-containing medium to subconfluence, followed by growth arrest for 24h and pre-incubation with rapamycin 100nM for 6h. Then they were incubated with rapamycin 100nM in serum-containing medium under the influence of different stress factors: growth stimulation with endothelial cell medium, influence of H2O2, and heat shock for 2h at 40°C or 30min at 42°C. Controls were incubated in the same way without rapamycin. These experiments were performed with staged total incubation times reaching from 1,5h to 48h. The proteins were isolated from the cells and Western Blots with specific antibody stains for HSP40, HSP47, HSP60 and HSP70 were performed. RNA was isolated to perform reverse transcriptase PCR with specific primers for HSP70. Results and Discussion: The gene arrays showed a significant down-regulation of the genes for the above mentioned heat shock proteins under the influence of rapamycin in pattern 1). This is a feasible mechanism for the drug, as the role of the heat shock proteins in atherogenesis is well described. Our further experiments showed that the expression of the heat shock proteins can be stimulated by the stress factors that we applied, especially by heat shock. An inhibition of this stimulation by rapamycin was observed for HSP40 and HSP70 in some experiments. This was not observed throughout all our experiments, so our results do not justify the conclusion that this is a mechanism of action of rapamycin in human vascular smooth muscle cells. The gene arrays also showed that rapamycin, when continuously applied to cells stimulated by serum, regulates the expression of various proteins of the extracellular matrix such as COMP/TSP-5 and type VI collagen. We also observed an up-regulation of bone morphogenetic proteins 2 and 6, which is noteworthy because these proteins have been associated with the calcification of atherosclerotic lesions.