Aging of cerebellar granule neurons in vitro

Abstract

Aging is slow and cumulative process and is experimentally difficult to access. Neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease are considered to be at high risk with increasing age. The molecular mechanisms by which they occur are not completely understood. Aim of the present study was to construct and investigate an in vitro model of neuronal aging. To this purpose we used rat primary cerebellar granule neurons which are a good characterized in vitro model for various paradigms of neuronal cell death, e.g. potassium deprivation or glutamate excitotoxicity. We prepared CGN to a purity of 95% and kept them in culture for either 7 days or up to 60 days. To validate our in vitro model for aging, we tested whether known molecular changes associated with aging occur over time. Moreover, by using DNA microarray analysis we examined how aging in vitro influences the pattern of gene expression. In the end, we studied mechanisms of cell death signaling cascades in young vs. old CGN. Old CGN had increased protein carbonylation and ubiquitination. Proteasomal activity was significantly lower in old CGN even though protein expression of proteasomal subunits did not change over the time. Morphological changes in astrocytes included increase in size, accumulation of autofluorescent, undegradable pigment lipofuscine, and senescence-associated beta -galactosidase activity. Aging in vitro caused increased expression of genes involved in stress response. Down-regulated genes were mostly responsible for control of synaptic function. Young neurons favored apoptosis over necrosis in contrast to old neurons. DIV 50 neurons were much less vulnerable as compared to DIV 7 neurons to classical apoptotic paradigms such as potassium deprivation, or staurosporine treatment. Old CGN had up-regulated anti-apoptotic proteins Bcl-xL and lifeguard, and down-regulated caspase-3 and Bax. On the other hand, old neurons exhibited enhanced sensitivity to glutamate excitotoxicity. Aging in vitro caused ATP depletion, failure of intracellular Ca2+ homeostasis, increase in calpain activity, and changes in ERK signaling. Increased calpain activity caused cleavage of calcium pump NCX3 and blocked pumping excessive Ca2+ outside of the cell. This made old neurons extremely sensitive glutamate insult. When calpains were inhibited over longer period of time by regular application of calpeptin, sensitivity to excitotoxic stimulus was significantly reduced. These data show that cerebellar granule neurons can successfully be cultured over period of 60 days in vitro and may represent a valuable tool for modeling aging and neurodegenerative diseases.

Der Alterungsprozess ist ein langsamer und kumulativer Vorgang, der experimentell nur schwer erfassen ist. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson sind Erkrankungen, die im Alter eintreten können. Der molekulare Mechanismus dieser Erkrankungen ist nicht vollständig aufgeklärt. Das Ziel dieser Studie war es ein in-vitro Modell zu entwickeln und daran den Alterungsprozess auf neuronaler Ebene zu untersuchen. Dazu wurden primäre zerebellare Körnerzellen (CGN = cerebellar granule neurons) der Ratte verwendet. Diese haben sich als sehr gute in-vitro Modelle für diverse Variationen von neuronalem Zelltod, wie z.B. Kalium-Deprivation oder Glutamat-Exotoxizität erwiesen. Wir reinigten die CGN zu 95% auf und kultivierten die aufgereinigten Zellen im Nährmedium zwischen 7 und 60 Tage. Zur Validierung unseres in-vitro Alterungsmodels führten wir für den Alterungsprozess evaluierte molekulare Testreihen durch. Darüber hinaus untersuchten wir mit DNA microarray Analyse in wieweit in-vitro-Alterung der Zellen die Genexpression beeinflusst bzw. verändert. Zudem untersuchten wir die Mechanismen der Zelltod-Signalkaskade in jungen CGN im Vergleich zu gealterten CGN. Alte CGN haben eine erhöhte Protein-Karbonylierung und -Ubiquitinierung. Die proteasomale Aktivität war signifikant niedriger in alten CGN obwohl die Proteinexpression der proteasomalen Untereinheiten sich über die Zeit nicht veränderte. Morphologische Veränderungen in Astrozyten schlossen Vergrößerung, Akkumulation der Autofluoreszenz, nicht abbaubare Lipofuscin Pigment, und mit Vergreisung assoziierte Beta-Galaktosidase Aktivität ein. Der in vitro Alterungsprozess verursachte eine Expression von Genen die erwiesenermaßen in der Stressantwort eine Rolle spielen. Wohingegen die Expression von Genen, die meist für die Kontrolle der synaptischen Funktion verantwortlich sind, herabgesetzt waren. Junge Neurone starben im Gegensatz zu den gealterten Zellen eher durch Apoptose als durch Nekrose. DIV 50 Neurone waren im Vergleich zu DIV 7 Neurone weniger anfällig für klassische Apoptose-Arten wie Kaliumdeprivation oder Gabe von Staurosporinen. Alte CGN hatten einen erhöhten Spiegel der anti-apoptotischen Proteine Bcl-xl und Lifeguard, und einen abgesetzten Spiegel der Apoptose-induzierenden Protease Caspase-3 und dem Protein Bax. Andererseits zeigten die alten Neurone eine erhöhte Erregbarkeit durch Glutamat. Der in-vitro Alterungsprozess verursachte zudem eine ATP-Verarmung, eine Versagen der intrazellulären Ca2+-Homöostase, eine Erhöhung der Calpain-Aktivität und Veränderungen in ERK-regulierten Signalkaskaden.Die Erhöhung der Calpain-Aktivität verursachte eine Spaltung der Kalziumpumpe NCX3 und blockierte damit die übermäßige Abgabe von Ca2+ nach außen. Dies führte dazu, dass gealterte Neuronen extrem sensitiv für auf Glutamat-Insulte waren. Wenn Calpain über eine längere Zeit durch die Gabe von Calpeptin inhibiert wurde, war die Sensitivität auf exozytotische Stimuli herabgesetzt. Diese Daten zeigen, dass zerebellare Körnerzellen erfolgreich über eine Zeitdauer von 60 Tagen in vitro kultiviert werden können und daher ein nützliches Modell für den Alterungsprozess und neurodegenerative Krankheiten darstellt.