Die Erstbeschreibung zweier bisher unbekannter AntiHif1a-Varianten

Abstract

Die Reaktion der Zelle und des Organismus auf Hypoxie und Belastung war der physiologische Hintergrund dieser Arbeit, wobei wir mit dem Transkriptionsfaktor Hif1 einen innerhalb der Zelle zentralen Teil dieser Anpassungsreaktion untersuchten. Der Transkriptionsfaktor Hif1 ist ein Protein, das aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist. Die b-Untereinheit ist stets auf einem basalen Niveau exprimiert, wohingegen die a-Untereinheit einer Sauerstoff-abhängigen Regulation unterliegt. Für Hif1a gilt als erwiesen, dass es einer posttranskriptionellen Regulation unterliegt. Aus diesem Grund ist besonders interessant, dass für die mRNA der a-Untereinheit (Hif1a mRNA) sowohl die Existenz verschiedener Varianten als auch einer antisense Variante (aHif1a) bekannt ist. antisense Variante bedeutet, dass es eine RNA gibt, die zumindest in einem gewissen Abschnitt komplementär zur Hif1a mRNA ist und die in der Lage ist, durch Hybridisierung mit der Hif1a mRNA selbige in irgendeiner Weise zu beeinflussen. Mit dieser Arbeit erhoffen wir, durch untersuchen der differentiellen Expression von aHif1a und Hif1a einen ersten Beitrag zur Aufklärung der Relevanz von aHif1a leisten zu können. Hierzu wurde vorab die Hif1a mRNA und die bisher bekannte aHif1a Variante mittels einer in silico Analyse untersucht. Dabei zeigte sich, dass es wahrscheinlich ist, dass mindestens eine gesplicte, bisher unbekannte aHif1a Variante existiert. Mittels einer PCR, Gelelektrophorese und anschließender Sequenzierung konnten aus PBMC Proben von Ausdauersportlern, zwei bisher unbekannte gesplicte aHif1a Varianten isoliert werden. Eine erneute in silico Analyse des Ergebnisses erbrachte die Bestätigung, dass es sich um antisense Varianten handelt, die wir mit aHif1aEx14 und aHif1aEx2 benannten. Das besondere an aHif1aEx14 ist, dass es komplementär zu einem Bereich der Hif1a mRNA ist, der durch alternatives Splicing fakultativ exprimiert wird. Um erste Anhalte über die mögliche Funktion der gesplicten aHif1a Varianten zu bekommen, wurden die gesplicten aHif1a Varianten und die bekannten Hif1a mRNA Varianten mittels real time RT-PCR hinsichtlich differentieller Expression unter Hypoxie und Belastung und hinsichtlich ihrer vorwiegenden Lokalisation untersucht. Es zeigte sich, dass beide Varianten unterschiedliche Lokalisationen aufweisen. aHif1aEx14 ist eher zytoplasmatisch zu finden, wohingegen aHif1aEx2 vorwiegend nukleär lokalisiert ist. Durch einen Vergleich mit EGR1, einem immediate early gene, konnte gezeigt werden, dass keine der aHif1a oder Hif1a Varianten im Sinne eines immediate early genes unter körperlicher Belastung oder Hypoxie reguliert wird. Allerdings fand sich sowohl in der Ausdifferenzierung von Myoblasten zu Myotuben als auch in der Behandlung von Myotuben mit Kobaltchlorid eine differentielle Regulierung beider antisense Varianten. Wobei lediglich aHif1aEx14 in ihrem differentiellen Regulationsverhalten signifikant mit den beiden Hif1a Varianten korreliert war. In einer abschließenden Versuchsanordnung wurden verschiedene Gewebe auf ihre Expression der gesplicten aHif1a Varianten gescreent. Dabei war das zentrale Ergebnis, dass die gesplicten aHif1a Varianten in allen untersuchten Geweben exprimiert werden. Weitere Untersuchungen werden nötig sein, um exakte Aussagen über die genaue Größen und die Interaktionen der aHif1a Varianten mit den Hif1a Varianten machen zu können, und um daraus letztlich die Funktion der aHif1a Varianten ableiten zu können.

The reaction of the cell and the organism to hypoxia and stress was the physiological backround to this paper, whereas we explored with the transcription factor Hif1 a central part of the reaction within the cell. The transcription factor Hif1 is a protein, which is build from two subunits. The b-subunit is always expressed at a basal level. Whereas the a-subunit undergoes a oxygen dependent regulation. It was shown, that Hif1a undergoes a posttranscriptional regulation. Therefore it is of special concern, that the existence of mRNA variants and antisense variants of Hif1a was shown in the past. Antisense means, that a RNA exists which is at least partially complemental to the Hif1a mRNA and is able to affect the mRNA by hybridation. With this paper we hope by examination of the differential expression of aHif1a and Hif1a to contribute information of the relevance of aHif1a. Therefor we first examined the Hif1a mRNA and known aHif1a variants using an in silico analysis. Thereby it appeared that at least one spliced so far unknown aHif1a variant most likely exists. Using PCR, gel electrophoresis and following sequencing two so far unknown spliced aHif1a variants could be isolated from PBMC samples from athletes. Another in silico analysis of the result approved that these variants act as antisense variants. We appointed them by aHif1aEx14 and aHif1aEx2. Special about aHif1aEx14 is, that it is complementary to a part of the Hif1a mRNA, which is optional expressed by alternativ splicing. To gain first knowledge about the possible function of the spliced aHif1a variants, the spliced aHif1a variants and the known Hif1a variants were examined concerning differentiel expression under hypoxia and stress and their predominant localisation. The results indicated that both variants show a different localisation. aHif1aEx14 is rather cytoplasmatic whereas aHif1aEx2 is rather located in the nucleus. By comparison with EGR1, an immediate early gene, we showed, that non of the aHif1a or Hif1a variants are regulated as an immediate early gene under physical stress or hypoxia. But there was a differential regulation of both antisense variants during the differentiation of myoblasts to myotubes and also during the attendance of myotubes with cobald-chloride.Whereas only aHif1aEx14 was correlated in its differentiell regulation with the two Hif1a variants. In a concluding experiment different tissues were examined concerning their expression of aHif1a. The spliced aHif1a variants were found in all examined tissues. More analyses are necessary to declare the exact size and interaction of the aHif1a variants with the Hif1a variants and finally to deduce the functions of the aHif1a variants.