Das neue AZT-PFA-Duplex-Virostatikum N3: Synthese, in vitro Aktivität und Stabilität

Abstract

Im ersten Teil der Arbeit werden Verbesserungen der mehrstufigen Synthese des neuentwickelten AZT-PFA-Duplex-Virostatikums (N3) aufgezeigt. Durch die Optimierung kann die Verknüpfung der beiden Virostatika 3´-Azido-3´-desoxythymidin (AZT) und Phosphonoameisensäure (PFA), die vorher nur in 1 - 2 g Ansätzen möglich war, jetzt im 10 - 20 g Maßstab praktikabel durchgeführt werden, so dass die Synthese auch für technische Maßstäbe geeignet ist. Außerdem gelang die Kupplung über ein enantiomerenreines Glycerinlipidgerüst (N3sn), die bisher nur über eine racemische Glycerinlipidbrücke (N3rac) möglich war. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine vergleichende Untersuchung der antiviralen Wirkung von ACV und N3 gegen HSV1-Virusstämmen von Patienten nach Stammzelltransplantation durchgeführt. Hierzu werden Monolayer von Vero-Zellkulturen mit 3 ACV sensitiven (KOS, HSV-K161, HSV-L177) und 3 ACV resistenten (KOS-M, HSV-K143, HSV-L182) HSV-1 Viruslysaten infiziert. Anhand der IC50-Werte, die mit dem SPRA-Test semiquantitativ und anschließend mit dem PRA-Test und der PROBIT-Transformation quantitativ bestimmt werden, wird ermittelt, dass sich N3 und ACV bei ACV-sensitiven Viruslysaten in ihrer antiviralen Aktivität entsprechen. Dagegen zeigt sich an den HSV-Viruslysaten, die im Verlauf der ACV-Therapie eine mutationsbedingte Resistenz entwickelt haben, zwar der Verlust der antiviralen Wirkung von ACV, aber keinerlei Verminderung der antiviralen Aktivität von N3. Die antivirale Wirkung von N3 wird hierbei nicht wesentlich durch die Konfiguration des Glyceringerüstes beeinflusst. Hervorzuheben ist, dass die antivirale Aktivität von N3 selbst nach der 130 stündigen Inkubation bei 37°C im Humanserum praktisch nicht abnimmt, da die IC50-Werte bei Vero-Zellen, die mit dem ACV resistenten Viruslysat HSV-L-182res infiziert wurden, sind in diesem Zeitraum unverändert. Bei der Inkubation mit EDTA-Humanblut zeigt N3, im Verlauf von 96 h, abgesehen von zwei leichten Schwankungen im Bereich von 1 h (Steigerung) und von 12 h (Abschwächung), praktisch keine Änderungen in den IC50-Werten. Dagegen fällt die antivirale Aktivität von ACV von anfänglich IC50 = 28,52 µM auf IC50 = 41,52 µM. Der Befund zeigt, dass die Stabilität des Duplex-Virostatikums im EDTA-Humanblut nicht nur unerwartet hoch ist, sondern auch die von ACV übertrifft. Im Falle der Veresterung des Phosphonoameisensäurerestes mit Ethanol, wobei das Duplex-Virostatikum N4 erhalten wird, tritt zwar innerhalb 1 h eine mit N3 vergleichbare virostatische Wirkung auf, die aber bereits nach 12 h nicht mehr nachweisbar ist. Für die antivirale Wirkung der Duplex-Virostatika ist somit das Vorhandensein eines freien Phosphonoameisensäurerestes eine grundsätzliche Voraussetzung. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wird anhand des Blutausstriches und mit Hilfe der Bestimmung des freien Hämoglobins durch das Dade Dimensions RxL-Analysegerät gezeigt, dass N3 keine nachweisbaren Schäden an den Blutbestandteilen verursacht. Da weder die antivirale Wirkung von N3 bei Zugabe von Humanblut verändert noch die Blutbestandteile geschädigt werden, sollte eine i.v.- Applikation der neuen AZT-PFA-Duplex-Virostatika bei geplanten in vivo Testungen problemlos erfolgen können.

The first part of the thesis outlines improvements for the multi-step synthesis of the new antiviral AZT-PFA duplex drug (N3), that links the two antiviral drugs 3’Azido-3’desoxythymidine (AZT) and phosphonoformic acid (PFA). Previously only 1-2 g scales could be yielded. The improved synthesis yields an outcome of up to 10 to 20 g and meets the requirements for technical scales. Furthermore a coupling via an enantiomer clean gylcerinlipid chain (N3sn) was realized, which was so far only possible via a racemic glycerinlipid chain (N3rac).

The second part of the thesis focuses on comparative experiments in terms of the antiviral effect of ACV and N3 against HSV1-viral isolates from patients after stemcell transplantation. Monolayers from vero cells were infected with 3 ACV sensitive (KOS, HSV-K161, HSV-L177) and 3 ACV resistant (KOS-M, HSV-K143, HSV-L182) HSV1 virus lysates. The IC50 values, that were evaluated semiquantitatively with the SPRA-Test and subsequently quantitatively with the PRA-test and the PROBIT-transformation, showed that N3 and ACV act equivalently in ACV sensitive strains. In contrast to the loss in effectiveness of ACV in HSV viral lysats that developed a mutationally driven ACV resistance under ACV treatment, there is no loss of effectiveness of N3 in those lysats. The antiviral effect of N3 is not markedly affected by the configuration of the glycerinresidue. It has to be emphasized that the activity of N3 does not change after incubation for 130 hours in serum at 37 °C. This follows from the observation that the IC50 values of the vero-cells, that have been infected with the ACV resistant virus lysat HSV-L-182res, remain unchained within that period. N3 shows almost no changes in IC50 values during the incubation of EDTA-human-blood during a 96 hour course. Except two minimal changes a small increase after 1 hour and a small decrease after 12 h. On the contrary, the antiviral activity of ACV decreases from the first IC50 = 28,52 µM to IC50 = 41,52 µM. The results show that the stability of the duplex drug is not only remarkly high but also surpasses the stability of ACV. In the case of an esterfication of the phosphonoformiate residues with ethanol that results in the duplex drug N4, a comparable stability to N3 is reached within the 1st hour. However, this is not detectable after 12 hours for an antiviral effect of the duplex drug the existence of a free phosphonoformate residue is an essential condition. The third part of the thesis uses a blood smear and a determination of free haemaglobin with a Dade Dimensions RxL-Analysis machine shows that N3 does not cause any detectable damage to the blood components. As the antiviral effect of N3 neither affects the human blood nor the corpuscular blood components, an i.v. application of the new AZT-PFA-duplex drug should be considered following further in vivo studies.