Analysen des hämatopoetischen Chimärismus in Zellsubpopulationen mit Hilfe der fluoreszensmarkierten STR-PCR bei Kindern mit akuten Leukämien. Erarbeitung prognostischer Parameter zur Rezidivfrüherkennung.

Abstract

Im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation (SZT) stellt heute das Wiederkehren der Grunderkrankung bei Kindern mit akuten Leukämien die Hauptursache für ein Therapieversagen dar. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass ein zunehmender gemischter Chimärismus entscheidende Hinweise auf ein drohendes Rezidiv liefert. Durch eine frühzeitige immunologische Interventionen konnte in diesen Fällen bei 1/3 der betroffenen Patienten eine erneute langanhaltende Remission erreicht werden. Durch die rasche Entwicklung der Erkrankung ist es nur bei einem Teil der Kinder möglich ein drohendes Rezidiv durch Vollblutanalysen rechtzeitig zu erfassen, um mit einer Immuntherapie adäquat reagieren zu können. Als Ursache ist unter anderen die geringe Sensitivität der STR-PCR anzunehmen, mit der es lediglich möglich ist, eine Minorzellpopulation von 1 % zu erkennen. In der vorliegenden Studie wurde mit Hilfe der STR-PCR der Chimärismusverlauf von 114 Kindern mit akuten Leukämien (84 ALL, 30 AML) im Vollblut und im Knochenmark (KM) prospektiv untersucht. Mit dem Ziel, die Sensitivität und Spezifität dieser Methode zu erhöhen, wurden zusätzlich aus den 239 Knochenmarksproben die Leukämieantigen-assoziierten-Subpopulationen (in der ALL die CD3-, CD10-, CD19-, CD34- und in der AML die CD33-, CD34-Zelllinie) immunomagnetisch separiert und in die Untersuchungen mit einbezogen. Der Untersuchungszeitraum betrug im Median 453 Tage (min. 16 Tage / max. 1586 Tage). Fünf der 30 an einer AML erkrankten Kinder und 27 der 84 Kinder mit einer ALL erlitten ein Rezidiv. Bei den Kindern, bei denen autologe Anteile in den Subpopulationen und im Knochenmark zum Zeitpunkt des Rezidives nachgewiesen werden konnten, war der gemischter Chimärismus (MC) in den untersuchten Subfraktionen meist stärker ausgebildet. Allerdings gelang dieser Nachweis im Verlauf der Rezidivdiagnostik nicht in allen Proben. Bei 14/21 Patienten mit einer ALL war ein MC in der CD34- und bei 15/23 in der CD19-Subpopulation mit dem Auftreten eines Rezidives assoziiert. Im Knochenmark konnten autologe Anteile bei 23 der 27 erkrankten Patienten nachgewiesen werden. Bei Patienten mit einer AML scheint die Assoziation eines Rezidives mit der CD34-Zellinie am stärksten ausgeprägt zu sein. In kompletter Remission (CR) entwickelten in der CD19-Subpopulation nur 6/49 der ALL-Patienten einen gemischten Chimärismus; im Gesamtknochenmark hingegen trat letzterer vergleichsweise häufiger auf (13/50). In der T-Zellfraktion des Knochenmarks war er bei 15/50 Patienten nachzuweisen. Auf Grund der häufigeren Vollblutuntersuchungen innerhalb der ersten zwei Monate nach SZT ist hier ein gemischter Chimärismus ein häufig beobachtetes Ereignis (25/50). Um einen Eindruck zu bekommen, ob die eigentliche Blastenlast der untersuchten Knochenmarksproben mit den Chimärismusergebnissen der untersuchten Subfraktionen korreliert, wurden die Ergebnisse der STR-PCR-Methode mit den Ergebnissen der RT-PCR verglichen. Anhand von Ig/TCR-Rearrangements ermöglicht die RT-PCR die Blastenlast einer Probe zu verifizieren. Im Vollblut trat in dieser Untersuchung ein gemischter Chimärismus erst dann auf, wenn mehr als 3 Blasten unter 1.000 gesunden Knochenmarkszellen nachgewiesen wurden (0,3 %). Die Sensitivität der Analysen des Knochenmarks und der Subpopulationen lag dagegen deutlich höher. Hier ließ sich schon eine Blastenlast von 5 leukämischen Zellen unter 10.000 Gesunden (0,05 %) detektieren. Aus diesem Grund waren autologe Anteile im Knochenmark vor der klinisch gestellten Diagnose eines Rezidives weitaus früher nachzuweisen als im Vollblut (Median 67 Tage vs. 5 Tage). In den Subpopulationsanalysen lag dieser diagnostische Vorlauf im Median bei 40 Tagen. Die Assoziation eines gemischten Chimärismus mit dem Auftreten eines Rezidives war innerhalb der ersten 150 Tage nach der Stammzelltransplantation in den Knochenmarksanalysen am höchsten und betrug 28 %. In den Subpopulationen lag dieser Anteil im Durchschnitt bei 20 % und in den Vollblutuntersuchungen bei 17 %. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass durch die Analyse von Subpopulationen eine deutliche Sensitivitäts- und Prädiktivitätssteigerung der STR-PCR gegenüber den Vollblutuntersuchungen im Rezidivmonitoring zu erreichen ist. Im Vergleich zu den Analysen des Gesamtknochenmarks konnte jedoch kein signifikanter Informationsgewinn erzielt werden. Die erhobenen Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass gemischte Chimäre sowohl in den Knochenmarks- als auch in den Subpopulationsanalysen einen negativen Prädiktor im Hinblick auf das Therapieoutcome darstellen.

The main goal of post-transplantation monitoring in haematopoetic stem cell transplantation (HCST) is to predict negative events, such as disease relapse, graft rejection or graft-versus-host disease. For children with acute leukeamias today the recurrence of the underlying disease is the main cause of treatment failure. In previous articles it was shown that increasing levels of recipient cells (increasing mixed chimerism, MC) provide a crucial indication of an impending relapse. In these cases a new sustained remission can be achieved by early immunological intervention. Because of the rapid progression of acute leukaemias, the detection of an impending relapse by analysis of venous blood samples is only feasible for 1/3 of these children. One reason could be the low sensitivity of the quantitative technique available. Using polymerase chain reaction (PCR) relying on repetitive DNA sequences, i.e short tandem repeats (STR), the threshold to detect minor cell populations is determined by 1 %. In this prospective study the chimaeric development of 114 children with acute leukaemia (84 ALL, 30 AML) was examined in venous blood samples (VB) and bone marrow samples (BM) via amplification of short tandem repeats (STR-PCR). With the goal to improve the sensitivity and specifics of this method, leukaemic-antigen associated celllineages (ALL: CD3-, CD10-, CD19-, CD34-; AML: CD33-, CD34-subpopulation) were separated out of the 239 bone marrow samples using an magnetic cell seperation technique and additionaly included into the research. The median timeframe investigated was 453 days (min. 16 days / max. 1586 days). In 32 of the investigated cases (AML 5/30 patients, ALL 27/84 patients), frank haematological relapse occurred. In cases in which mixed chimaersim was detected at time of relapse, MC was most prevalent in the monitored cell lineages. However, the proof of mixed chimaerism wasn’t successful in all samples taken in this timeframe. In CD34-positive cells MC could be verified in 14/21 cases of children suffering ALL and in the CD19-subfraction in 15/23 cases. In bone marrow samples increasing mixed chimaerism was detected in 23/27 patients. In samples from Children suffering AML, the association between relapse and MC was most strongly represented in the CD34-positive cells. 50 patients suffering ALL remained in remission post-transplantation. Only 6 of these children developed MC in the CD19-subfraction; in bone marrow samples 13. In T-cell associated cells (CD3) MC appeared in 15/50 cases. During the first two months post-transplantation autologous cells in venous blood samples were a commonly found incident in 25/50 cases due to the frequent examinations. The real amount of leukaemic cells can be determined by real-time PCR (RT-PCR) relying on Ig/TCR-Rearrangements. The numbers of malignant cells evaluated with this qualitative technique were compared with the results taken by analysis of STR-PCR. In venous blood samples, MC did not appear until more than 3 malignant cells in 1000 non-malignant (0,3%) could be detected by RT-PCR. In samples of bone marrow and purified cell lineages, MC could be detected at 0,05%. For this reason, autologous cells before frank relapse were determined in bone marrow samples sooner then in venous blood samples (median 67 days in comparison to 5 days). The median of days between first MC and frank relapse was about 40 days. Within the first 150 days post transplantation, the association of recipient cells and relapse was highest in analysis of bone marrow samples (28%). In analysis of subpopulation samples, the average was about 20%, in venous blood samples about 17%. In conclusion, analysis of leukaemic cell lineages increases the sensitivity and the predictability of the STR-PCR technique to detect an impending relapse versus venous blood testings. In comparison to analysis of bone marrow no significant benefit was obtained. This data leads to the conclusion that an MC both in leukaemic specific-celllinages and bone marrow samples, seems to be a negative predictor in regard to the therapeutic outcome.