Expression der Arginase Isoformen in Fibroblasten während der Wundheilung

Abstract

Einleitung: Prolin und Polyamine sind die Endprodukte beim Abbau der semiessentiellen Aminosäure L-Arginin mittels der Enzyme Arginase 1 (Arg1- zytosolisch) und Arginase 2 (Arg2 - mitochondrial). Diese Abbauprodukte sind essentielle Bestandteile der Kollagensynthese und der Zellproliferation. Der Gegenspieler zu Arginase ist das Enzym iNOS ("inducible Nitric oxide synthase"), welches L-Arginin zu NO konvertiert. Vorangegangene Arbeiten konnten zeigen, dass ein Mangel an NO zu einer verzögerten Wundheilung führt. Die Zytokine TGF-ß1 und IL-4 modulieren sowohl die Kollagensynthese als auch die Zellproliferation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Effekt der profibrotischen Zytokine TGF-ß1 und IL-4 auf den L-Argininstoffwechsel in NFB und WFB zu untersuchen. Methoden: Zur Gewinnung von Wundfibroblasten (WFB) wurden männlichen Lewis Ratten subkutan Polyvenylschwämmchen implantiert und nach 5, 10 und 21 Tagen explantiert. Die normalen dermalen Fibroblasten (NFB) konnten aus unpräparierten Kutisstücken von männlichen Lewis Ratten gewonnen werden. Anschließend wurden die Zellen in Zellkultur mit IL-4 (1-100 ng/ml) oder mit TGF-ß1 (0,1-5 ng/ml) stimuliert. Die RNA wurde extrahiert und mit spezifischen Primern für die Enzyme Arg1, Arg2, iNOS und den Membrantransporter CAT-I mittels RT-PCR untersucht. Als Kontroll-Gen wurde GAPDH verwendet. Die Gele wurden mit dem Programm AIDA ausgewertet. Ergebnisse: Im Gegensatz zu den NFB konnte iNOS zu jedem Zeitpunkt in den WFB nachgewiesen werden. Auch die Zugabe von IL-4 oder TGF-ß1 zeigte in den NFB keinen Effekt auf die iNOS Expression. In den WFB wurde durch die Zugabe des Zytokins IL-4 in Dosierungen von 1-5 ng/ml die iNOS Expression vermindert, ab einer Zugabe von 10 -100 ng/ml IL-4 zeigte sich eine Steigerung der Expression von iNOS. Eine Zugabe von TGF-ß1 beeinflusste dagegen die iNOS Expression in WFB nicht. Die Expression von Arg I konnte sowohl in WFB als auch in NFB mit IL-4 dosisabhängig gesteigert werden. Mit dem Zytokin TGF-ß1 zeigte sich in WFB ebenfalls dosisabhängig ein Anstieg der Expression von Arg I, in NFB war dieser Effekt in geringerer Ausprägung nachweisbar. Arg II konnte in beiden Zelltypen detektiert werden. Dabei zeigten sich in WFB und NFB sowohl initial als auch nach Stimulation mit IL-4 und TGF-ß1 keine Unterschiede. Eine Steigerung der CAT-I Expression konnte nur in WFB und mit 5 ng/ml TGF-ß1 erreicht werden. Zusammenfassung: Die Schlüsselenzyme für den Argininstoffwechsel - Arginase und iNOS - werden durch die Zytokine TGF-ß1 und IL-4 spezifisch und unterschiedlich in den NFB und WFB reguliert. Mit diesen Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass sich der Fibroblast der Haut im Rahmen der Wundheilung phänotypisch einem deutlichem Wandel unterzieht.

Background: Wound derived fibroblasts (WFB) are phenotypically different from normal dermal fibroblasts (NFB). Previous data has shown that this distinct phenotype is partially related to induction of iNOS in WFB. Inhibition of iNOS impairs wound healing and iNOS knock-out mice have delayed wound closure. Previous work has also shown that WFB have an induced arginase pathway, the alternative pathway for arginine metabolism. TGF-ß1 and Interleukin-4 modulate collagen synthesis and cell proliferation. Both are strong stimulators of arginase activity and inhibitors of iNOS in macrophages. The uptake of extra cellular arginine is regulated through cationic aminoacid transporter (CAT-I). The aim of this study was to investigate the effect of the cytokines TGF-ß1 and IL-4 on l-arginine pathway in NFB and WFB. Methods: Male Lewis rats were used to extract cells. NFB were harvested from uninjured skin and WFB from subcutaneously implanted PVA sponges from day 5, 10 and 21 after wounding. RNA was extracted from the cells. Using arginase isoform I, II, CAT-I and iNOS specific primers, cDNA was amplified by RT-PCR. GAPDH was used as house-keeping gene. Cells were stimulated with IL-4 (1-100ng/ml) and TGF-ß1 (0,1-5 ng/ml) and RNA was harvested. Analysis was performed by AIDA. Results: Compared to NFB which did not show any expression of iNOS, WFB from all time points expressed iNOS. iNOS expression was down- (1-5g/ml) and upregulated (10-100 ng/ml) by IL-4 in WFB but not in NFB. Arginase isoform I however was upregulated by IL-4 in both NFB and WFB. Arginase II was detected in both cell types, but did not show any difference at any point of time. TGF-ß1 induced dose depend arginase I in WFB, but SCHWÄCHER in NFB. CAT-I expression is increased only in WFBs with 5 ng/ml TGF-ß1. iNOS expression was unaffected by TGF-ß1 in WFB. Conclusion: The key enzymes of the arginine pathway - iNOS and arginase- are differentially regulated by IL-4 and TGF-ß1 in NFB and WFB suggesting distinct regulation mechanisms.