Der Wirkmechanismus des Replikations-Repressorproteins E8^E2C bei Humanpapillomviren

Abstract

Infektionen mit humanen Papillomviren (HPV) induzieren benigne Tumoren der Haut oder Schleimhaut, die besonders bei den so genannten "high risk"-Typen (u.a. 16, 18, 31 und 45) ein großes Risiko der malignen Konversion bedingen. Der Replikationszyklus des Virus ist eng mit dem Grad der Differenzierung der infizierten Epithelzellen verbunden. In den noch undifferenzierten Keratinozyten basaler Hautschichten kommt es zu einer persistenten Infektion, bei der nur eine begrenzte DNA-Replikation und Expression der frühen Virusgene stattfindet. Die zunehmende Differenzierung der infizierten Zellen verursacht die starke Amplifikation der Virusgenome, Expression der späten viralen Proteine und die Produktion infektiöser Virionen. Zwei virale, sequenzspezifisch an das HPV-Genom bindende Proteine regulieren dessen Replikation: E2 aktiviert die Replikation und kontrolliert die Genexpression; das durch alternatives Spleißen aus dem E2-Transkript gebildete E8^E2C des HPV31 ist der regulative Gegenspieler von E2, reprimiert die Replikation und ist ein Repressor des frühen Promotors P97. Die in HPV hoch konservierte, sehr kleine E8-Domäne ist eine übertragbare funktionelle Repressoreinheit, die auch über längere Distanzen wirkt. Die hier vorliegende Arbeit zeigt, dass E8^E2C mit zellulären Proteinen wechselwirkt, die an der Umwandlung von aktivem Euchromatin in inaktives Heterochromatin beteiligt sind. Eine solche Interaktion konnte gezeigt werden für drei Klasse I Histon-Deacetylasen (HDAC1, 2, und 3), den Transkriptionsfaktor und Korepressor TRIM28 sowie die Histon-Methyltransferasen SUV39H1 und SETDB1 und die DNA-Methyltransferase DNMT3a. Die Gabe von HDAC-Inhibitoren konnte die Transkriptionsrepression durch E8^E2C wieder aufheben, nicht jedoch die Repression der Replikation des HPV31 Ursprungs. Diese Ergebnisse legen nahe, dass E8^E2C über die Wechselwirkung mit zellulären, Chromatin modifizierenden Proteinen sowohl die Transkription als auch die Replikation des HPV Genoms reprimieren kann. Die zelluläre Maschinerie zur Heterochromatisierung besteht aus einem eng verflochtenen Netz miteinander interagierender Proteine, die in unterschiedlich stark reversiblen und aufeinander aufbauenden Schritten aktive Gene (Euchromatin) transkriptionell inaktivieren und schließlich dauerhaft stilllegen (Heterochromatin). Die in dieser Arbeit identifizierten Interaktionspartner von E8^E2C, HDAC1, 2 und 3, TRIM28, SUV39H1, SETDB1 sowie DNMT3A, erlauben, einen solchen spezifisch und über größere Entfernungen durch E8^E2C herbei geführten Pfad – ausgehend von der leicht reversiblen Deacetylierung der Histone über die Methylierung der Histonschwänze und die abschließende Methylierung der DNA im Bereich der E2-Bindestellen – auch für HPV-Genome nachzuvollziehen.

Infections with human papilloma viruses induce benign tumors of the skin or mucous membranes that carry a high risk of malignant conversion (especially with “high risk” HPV types e.g. 16, 18, 31 and 45). The replication cycle of the virus is linked to differentiation of infected epithelial cells. In undifferentiated ceratinocytes in the basal layers of the skin, a persistent infection is established with limited replication and expression of early virus genes. Progressing differentiation of infected cells causes high amplification rates of HPV genomes, expression of late virus genes and production of infectious virus particles. Two sequence-specific viral proteins bind to virus genomes and regulate gene expression; E8^E2C is generated by alternative splicing from E2 transcripts and is the regulative counterpart of E2, represses replication and transcription from viral early promoter P97. The very small E8 domain is highly conserved among HPV types and is a transferable repressor domain that works over long distances. The work presented here shows interaction of E8^E2C with cellular proteins that are involved in chromatin modification to switch from active euchromatin to inactive heterochromatin. Interactions are demonstrated for three class I histone deacetylases (HDAC1, 2, and 3), transcription factor and co-repressor TRIM28, histone methyl transferases SUV39H1 and SETDB1 and DNA-methyl transferase DNMT3a. Addition of HDAC inhibitors lifted repression of transcription by E8^E2C, but not repression of HPV31 origins. The results presented suggest that E8^E2C mediates its repression of transcription and replication via interaction with cellular chromatin modifiers. Heterochromatization is achieved by a tightly intertwined network of interacting proteins that modify active genes (euchromatin) in a series of consecutive reactions to inactivate transcription and finally silence genes completely (heterochromatin). The interaction partners of E8^E2C identified, namely HDAC 1, 2, and 3, TRIM28, SUV39H1, SETDB1 and DNMT3a, allow for a E8^E2C-induced, specific repression model that is effective over long distances from the promoter or replication origin, starting with the easily reversible deacetylation of histones via methylation of histone tails and finally the methylation of DNA residues at E2 binding sites.