Untersuchung der Kinetik der Wirkung von Clindamycin gegen Plasmodium falciparum in vitro

Abstract

Das Antibiotikum Clindamycin als selektiver Inhibitor der prokaryonten Proteinsynthese zeigt eine seit langem bekannte, aber wenig charakterisierte hemmende Wirkung gegen eukaryonte Apicomplexa, zu denen die Protozoen Toxoplasma gondii, dem Erreger der Toxoplasmose und Plasmodium falciparum, dem Erreger der Malaria tropica, gehören. In der Literatur zur In-vitro-Wirksamkeit von Clindamycin gegen Apicomplexa zeigen sich zum einen in mehreren Veröffentlichungen extrem hohe EC50, zum anderen eine merkwürdig verzögerte Kinetik der Wachstumshemmung. Die vorliegende Arbeit untersucht den zeitlichen Verlauf der Wirksamkeit von Clindamycin gegen Plasmodium falciparum in vitro. Es wird die Frage untersucht, ob der langsame Wirkungseintritt nach zwei Generationen durch einen Akkumulationseffekt nach kontinuierliche Einwirkung mit Clindamycin (time of exposure-dependent effect), oder durch ein verspätetes Einsetzen der Wirkung (delayed effect) hervorgerufen wird. Es wurden Experimente in vitro über mehrere parasitäre Zyklen von Plasmodium falciparum (144 h) und unterschiedlich langer Exposition (48 h versus 144 h) zu einem weiten Konzentrationsbereich von Clindamycin (1 bis 1x105 nM) durchgeführt. Das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung wurde zu den Zeitpunkten 0, 48, 96 und 144 h mittels eines etablierten ELISA mit monoklonalen Antikörpern gegen das parasitäre Protein PfHRP2 quantifiziert. Bis zur maximal eingesetzten Konzentration von 100.000 nM Clindamycin zeigte sich nach 48 und 96 h keine 50%ige Hemmung der PfHRP2-Synthese. Nach 144 h ergaben sich jedoch mittlere EC50 von 5,25 nM bei durchgehender Exposition und 7,24 nM bei Exposition zum Hemmstoff nur über die ersten 48 h des Versuchs. Der Vergleich zwischen den beiden experimentellen Armen einmal mit durchgehender, einmal mit nur 48-stündiger Exposition zeigt erstaunlich geringe Unterschiede. Das durchgeführte Kontrollexperiment mit Chloroquin bestätigte das eigenartige Wirkprofil vom Clindamycin. Chloroquin zeigte schon nach 48 h eine deutliche antiproliferative Wirkung, die errechneten EC50 zeigten wohl auch einen positiven Zusammenhang der Wirksamkeit mit dem zeitlichen Abstand nach Expositionsbeginn, nicht jedoch in den bei Clindamycin zu beobachtenden Dimensionen und die Unterschiede zwischen den zwei unterschiedlichen Expositionsdauern war bei deutlicher Hemmung signifikant. Diese Ergebnisse sind mit einem Modell der Hemmung der Synthese von apicoplastären Proteinen mit einer konsekutiven Hemmung der folgenden Schizogonie, wie bereits bei Toxoplasma gondii vermutet wurde, vereinbar.

The antibiotic Clindamycin as a selective inhibitor of prokaryotic protein synthesis shows a long known but only rudimentally characterized inhibiting action against eukaryotic Apicomplexa, such as the protozoan Toxoplasma gondii, the pathogen causing Toxoplasmosis and Plasmodium falciparum, the pathogen causing Falciparum Malaria. Publications about in-vitro-activity of Clindamycin against Apicomplexa are showing extremely high EC50 on the one hand and peculiarly delayed kinetics of growth inhibition on the other. This dissertation examines the chronological course of action of Clindamycin against Plasmodium falciparum in vitro. It also examines the question, if the slow onset of action after two generations is a time-of-exposure-dependent or a delayed effect. Experiments in vitro covering several parasitic cycles of Plasmodium falciparum (144 hours) with different times of exposure (48 h versus 144 h) to a wide range of Clindamycin concentrations (1 to 1x105 nM) were performed. Growth and proliferation were quantified using an established ELISA with monoclonal antibodies against parasitic PfHRP 2. Up to the maximum concentration of 100000 nM Clindamycin, an inhibition of PfHRP 2-synthesis of less than 50 % was found at time points 48 h and 96 h. After 144 h however mean EC50 of 5.25 nM with exposition throughout and 7.24 nM with exposition only for the first 48 h of the experiment were found. The comparison between the two branches revealed astonishingly small differences. The control experiment with Chloroquin confirmed the peculiar profile of action of Clindamycin. Chloroquin showed clear antiproliferative action after 48 h, calculated EC50 did show a positive correlation between efficacy and time after exposition, yet not in the dimensions observed with Clindamycin and differences between the two branches were significant where strong inhibition was found. These results are consistent with a model of inhibition of synthesis of apicoplastic proteins with consecutive inhibition of schizogony, a model that has been proposed in Toxoplasma gondii.