Charakterisierung des Proteins P275 in dendritischen Zellen

Abstract

Dendritische Zellen (DC) sind die effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems und vermitteln viele ihrer immunbiologisch wichtigen Aktivitäten über Oberflächenmoleküle. Seit der vollständigen Entschlüsselung des menschlichen Genoms vor wenigen Jahren, ist es mit Hilfe von subtraktiven DNA-Analysen möglich, Gene und durch sie kodierte Proteine zu identifizieren, die auf einem bestimmten Zelltyp differentiell exprimiert werden. In der Dissertationsschrift "Charakterisierung des Proteins P275 in dendritischen Zellen" wurde das Oberflächenprotein P275 und seine differentielle Expression auf DC näher charakterisiert. P275 zeigt eine große Ähnlichkeit mit dem N-System Aminosäuretransporter NAT-1 (SNAT-6). Es handelt sich bei P275 wahrscheinlich um eine Spleißvariante des NAT-1 Transporters. Zunächst wurde die Spezifität des für die Western Blot - Analysen eingesetzten polyklonalen Antikörpers für das Protein P275 nachgewiesen. Sowohl auf DNA-Ebene als auch Proteinebene konnte die differentielle Expression von P275 auf monozyten-generierten DC gezeigt werden. Eine durchgeführte Kinetik-Untersuchung über den Zeitpunkt der Expression zeigte, dass die Transkription von p275 und folglich auch die Expression des Proteins P275 zu einem frühen Zeitpunkt in der Entwicklung der DC aus Monozyten stattfindet. Eine Aktivierung der DC durch verschiedene Stimulanzien hatte keinen Einfluss auf die Stärke der Expression in den DC. Die Hemmung der DC-Entwicklung durch IL-10 führte im Gegensatz dazu zu einer Inhibition der Expression des Proteins P275. Durch weitere RT-PCR- und Western Blot-Versuche konnte gezeigt werden, dass das Gen AF070578 und sein Protein P275 neben aus Monozyten-generierten DC auch in aus CD34-positiven Stammzellen hergestellten DC vorhanden sind. Auf B- und T-Lymphozyten wird P275 hingegen nicht exprimiert. Das Protein P275 ist damit ein innerhalb der Leukozyten in bestimmten DC differentiell exprimiertes Protein, das zur näheren Charakterisierung der DC herangezogen werden kann.

Dendritic cells (DC) are the most effective antigen presenting cells of the immunesystem. They communicate a lot of of their important immunebiological functions by cellsurface-bound molecules. Since the complete decryption of the human genom a few years ago, it is possible to identify differentially expressed genes and their encoded proteins on different celltypes with the help of subtractive cDNA-libraries. The surface-molecule P275 and its differential expression on DC was investigated in the doctor thesis „Characterization of the protein P275 in dendritic cells“. P275 has a significant similarity to the N-system aminoacidtransporter NAT-1 (SNAT-6). It is very likely to be a splice variant of the NAT-1 transport protein. In a first step the specifity of the polyclonal antibody for the protein P275, which was used for the Western Blot analysis, was demonstrated. The differential expression of P275 in monocyte-derived DC was shown on the DNA- as well as on the protein-level. An analysis about the point in time of expression in the development of DC showed that the transcription of p275 and thus the expression of P275 takes place in an early phase of their developement from monocytes. The activation of the DC by different stimulating agents has no impact on the level of expression of P275. In contrast the inhibiton of DC-development by IL-10 leads to a complete lost of expression of P275. Further RT-PCR and Western Blot analysis showed, that the gene AF070578 and its protein P275 is also present in CD34-positiv-stemcell-derived dendritic cells besides monocyte-derived DC. On the other hand it is not expressed in B- and T-lymphocytes. Thus the protein P275 is expressed differentially on certain DC-subpopulation protein within the leukocyte population. As a conclusion it can be used for the further characterization and classification of dendritic cells.