Aktivität des neuen antiviralen Multiplex-Wirkstoffs AZT-Lipid-PFA im Mausmodell der intranasalen Cytomegalovirusinfektion

Abstract

Eine Gruppe 70 gesunder Balb/c Mäuse wurde intranasal (i.n.) mit subletalen Dosen (2x104 PFU) des murinen Cytomegalovirus (MCMV) infiziert. Zur Ermittlung der antiviralen in vivo Wirkung des neuen Multiplex-Wirkstoffes AZT-Lipid-PFA, von dem bisher nur in vitro Daten bekannt waren, wurden von dieser Gruppe 35 Mäuse zusätzlich an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 p.i. mit jeweils ca. 57 mg/kg dieses Wirkstoffs i.p. therapiert. Zur Kontrolle wurde mit einer zweiten Gruppe von 70 nicht infizierten Mäusen analog verfahren. Das Allgemeinbefinden der Mäuse änderte sich im Verlauf von 50 Tagen weder durch die Infektion noch durch die Therapie, wie aus Gewichtsmessungen gefolgert wurde.

An den Tagen 1, 5, 15, 22, 29, 36, 43, 50 p.i. wurde die mRNA jeweils aus zehn verschiedenen Lungenabschnitten einer Lunge von jeweils drei getöteten Mäusen aus allen Gruppen isoliert. Die mRNA der verschiedenen Lungenabschnitte wurde mit Hilfe eines Oligo-dT-Primers und der RT-PCR-Methode in cDNA transkribiert. Durch eine Amplifikation der cDNA, wobei verschiedene spezifische Primer für die MCMV-spezifischen immediate early Gene ie 1, ie 3 und das early Gen gB eingesetzt wurden und der anschließenden elektrophoretischen Trennung der Amplifikationsansätze wurden Gelchromatogramme erhalten, deren Bandenmuster Auskunft über den Verlauf der Virusinfektion gaben.

Die auftretenden Gelbanden zeigten, dass bei den intranasal infizierten Mäusen im Zeitraum von Tag 5 – 22 p.i. eine Virusreplikation (gB positiv) stattfand, das Virus ab Tag 29 mit der Ausnahme am Tag 43 (gB positiv), in den latenten Zustand (IE 1, IE 3 positiv) überging, der bis zum Versuchsende am Tag 50 in einigen wenigen Lungenabschnitten noch nachweisbar war. Bei den infizierten und therapierten Mäusen verlief die Virusinfektion analog bis auf zwei entscheidende Unterschiede. Am Tag 15 p.i. war die Virusreplikation (gB negativ) nicht detektierbar im Gegensatz zu den nicht therapierten Mäusen. Erst 3 Tage nach Beendigung der Therapie am Tag 22 p.i. wurde die Replikation wieder nachweisbar. Ab Tag 29 p.i. wurden keine Virusgene (IE 1, IE 3), die bei einer Viruslatenz zu erwarten waren, gefunden, die bei den infizierten, nicht therapierten Tieren in verschiedenen Lungenabschnitten mehr oder weniger deutlich detektierbar waren.

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass der neue Multiplex-Wirkstoff AZT-Lipid-PFA in vivo die charakteristische Wirkung eines Virusstatikums aufweist, d.h., eine Virusreplikation wird nur während der Dauer der Therapie teilweise oder völlig inhibiert. Das Virus wird aber hierbei nicht eliminiert. Es ist aber zu vermuten, dass der Wirkstoff die Eliminierung des Virus unterstützt.

Da mit dem verwendeten Mausmodell die antivirale Wirkung nicht quantifizierbar ist, muss mit einer quantitativen Methodik und entsprechenden Referenzvirusstatika die zwar gefundene, aber noch nicht endgültig bewiesene in vivo Wirksamkeit von AZT-Lipid-PFA weiter untersucht werden. Da im Verlauf der dreiwöchigen Therapie keine histopathologischen Auffälligkeiten in Lungen und Nieren aufgetreten sind, erfüllt der neue Wirkstoff eine wesentliche Voraussetzung, um weitere wünschenswerte präklinische Studien zu rechtfertigen.

The aim of the experiments was to evaluate the in vivo efficiency of the new multiplex-drug AZT-Lipid-PFA, which had only been tested in vitro so far. A group of 70 healthy Balb/c mice were intranasally (i.n.) infected with a subletal dose (2x104 PFU) of murine Cytomegalovirus (MCMV). 35 mice received a multiplex-drug treatment with 57 mg/kg intraperitoneally (i.p.) the other 35 mice received saline on day 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 post infectionem (p.i.).. A second group with 70 non-infected mice was handled analogue for control. Weight measurements showed that neither the infection nor the treatment had any negative effects on weight gain was detectable during the experimental period of 50 days.

On day 1, 5, 15, 22, 29, 36, 43, 50 p.i. three mice of every group were sacrificed and mRNA was harvested from ten different parts of each lung. The mRNA of the different parts of the lungs was transcribed into cDNA using Oligo-dT-primers and the RT-PCR-method. The amplification of cDNA using specific primers for the MCMV-specific immediate early gens ie 1, ie 3 as well as the early gen gB was employed followed by electrophoresis separation. The status of viral infection was assessed based on the presence of DNA bands.

The presence of gel bands indicated that the virus was replicating in the i.n. infected mice during day 5 – 22 p.i (gB positive). However, from day 29 p.i. onwards, with an exception of 43 p.i. (gB positive), the virus turned into a latent state (IE 1, IE 3 positive) and was only detectable in a few lung pieces at the end of the experiment on day 50 p.i.. Among infected mice, the treated group exhibited two significant differences compared with non-treated. Firstly, on day 15 p.i. there was no detectable viral replication (gB negative). Only on day 22 p.i., 3 days after the treatment was stopped, a replication was again detectable. Secondly, from day 29 p.i. onwards no virus gens (IE 1, IE 3) were detected. The gens would be detected if the virus remained in a latent state, as it was the case in the control group of the infected but non-treated animals.

The results suggested that the new multiplex-drug AZT-Lipid-PFA has the classic characteristics of a virostatic agent. Those typical effects are a partial or complete inhibition of the viral replication during the period of treatment. However, the virus was not eliminated by its therapy. However, you may assume that virus elimination is supported by its drug therapy.

This investigation represented the first in vivo study toward the use of AZT-Lipid-PFA as an antiviral agent. Though no quantitative data was shown with this mouse model, the drug gave positive antiviral results. In addition no histopathological abnormalities in the lungs or kidneys occurred. The in vivo effect of the AZT-Lipid-PFA should be further evaluated using a quantifiable method as well as with a reference virostatic agent as control.