The Rho-kinase Signaling Pathway in Tenon’s Capsule Fibroblasts and Retinal Ganglion Cells: A novel pharmacological target for improving the outcomes of filtration surgery and promoting retinal cell survival in glaucoma

Abstract

Glaucoma is characterized by the progressive loss of retinal ganglion cells (RGC) and their axons, giving rise to irreversible visual field defects leading to blindness when left untreated. The current methods of glaucoma treatment aim at reducing the intraocular pressure (IOP), the major risk factor arising from an imbalance between the production and outflow of aqueous humor. Glaucoma filtration surgery, which entails the creation of a scleral fistula that enables the drainage of aqueous humor, remains to be the most effective method for lowering the IOP. However, the wound healing activities of the Tenon’s capsule fibroblasts (TCF) result in the occlusion of the drainage channel and account for the surgical failure.

The Rho-kinase/ROCK signaling pathway is an intracellular convergence point for signals initiating the cytoskeletal alterations underlying the dynamic events involved in wound healing. The first part of this study therefore focused on the functions of the ROCK-pathway in human TCFs in vitro. With this purpose, the fibroblasts stimulated with serum were treated with H-1152P, a specific ROCK-inhibitor. Incubation of the TCFs with 10 µM H-1152P resulted in an 80-90% reduction in cell proliferation. H-1152P also caused the disassembly of stress fibers in a dose-dependent manner without exerting toxicity and without interfering with the protein kinase A (PKA) pathway. Migration of the fibroblasts and their contractility were also suppressed by H-1152P together with the impairment of fibronectin network assembly. These findings provide further evidence for the role of the ROCK-pathway in the wound healing activities of human TCFs and underline the potential of H-1152P as a safe and specific means to suppress these events.

Numerous extracellular signals that induce apoptosis also converge on the activation of ROCK. This places H-1152P mediated ROCK-inhibition as a novel approach for promoting the survival of RGCs in glaucoma, the efficacy of which was analyzed initially on isolated mouse retinae incubated without serum. The survival of the cells in the ganglion cell layer was severely impaired in this stringent in vitro model after 1 day. In contrast, 1 µM H-1152P considerably reduced the extent of apoptosis in all the retinal layers without interfering with PKA. The reactivity of astrocytes, Müller cells, and microglia were also significantly suppressed in retinae treated with H-1152P. In addition, a significant reduction was observed in the levels of various proinflammatory cytokines such as interleukin IL-3, IL-6, interferon-gamma, and tumor necrosis factor alpha released into the culture medium in response to H-1152P, which probably underlied the decrease in the toxicity of the conditioned media obtained from retinae incubated with this inhibitor. These results demonstrate that the neuroprotective effect of H-1152P mediated ROCK inhibition on retinal cells may be due to the suppression of glial cell reactivity to a certain extent, leading to the diminishing of cytokine release and to the suppression of secondary damage.

To analyze the direct effects of H-1152P on RGCs, the rat retinal ganglion cell line RGC-5 cultivated without serum was also utilised in this study. Despite the stability of this cell line, H-1152P at 1 µM exerted direct anti-apoptotic effects by specifically interfering with ROCK-dependent phosphorylation events. However, increasing the concentration of the inhibitor to 10-20 µM resulted in a dramatic increase in the amount of cells undergoing an oncotic cell death characterized by a marked cellular swelling. These highly contrasting effects of H-1152P are likely to have arisen from the molecular differences of the transformed cell line RGC-5 from primary RGCs, the further characterization of which are believed to be useful in providing more insight into the properties of both cell types as well as the mechanisms of oncosis.

The neuroprotective potential of H-1152P on RGCs after optic nerve crush (ONC) was also studied in collaboration with Dr. Frank Schüttauf from the University Eye Hospital in Tübingen. H-1152P administered at 1 µM led to a 1.6 fold increase in the number of surviving RGCs together with a decrease in the extent of glial cell reactivity 7 days after the ONC. These findings provide further support for the hypothesis suggesting that the suppression of reactive gliosis to a certain degree after axonal injury may indeed be beneficial in reducing the spread of secondary damage and rescuing the remaining ganglion cells. These data demonstrating the central role of the ROCK-signaling pathway in various cells implicated in the course of glaucoma also highlight the potential of the H-1152P-mediated targeting of this pathway as a promising anti-glaucoma therapy approach not only for suppressing the undesirable wound healing activities of Tenon’s capsule fibroblasts after glaucoma filtration surgery, but also for preventing further RGC loss.

Die glaukomatöse Opticusneuropathie ist charakterisiert durch eine Degeneration der Ganglienzellaxone und den progressiven Verlust retinaler Ganglienzellen (RGZ), der eine irreversible Schädigung des visuellen Systems nach sich zieht. Die derzeitigen Behandlungsmethoden zielen auf die Senkung des Augeninnendrucks (IOD) ab, dem Hauptrisikofaktor für das Glaukom, resultierend aus einem Ungleichgewicht zwischen Produktion und Abfluss des Kammerwassers. Die filtrierende Glaukomchirurgie stellt die wirkungsvollste Methode für die Senkung des IOD dar. Postoperative Wundheilungsaktivitäten der humanen Tenonfibroblasten (HTF) wie erhöhte Zellproliferation, Zellmigration, Zellkontraktion und Matrixproduktion führen jedoch zu einem Verschluss des für den Kammerwasserabfluss präparierten Filterkissens und tragen zu einem Misserfolg der Drucksenkung bei.

Eine zentrale Rolle bei der Organisation des Zytoskeletts während dynamischer Vorgänge wird dem RhoA-Protein und dessen Effektorprotein Rho-Kinase/ROCK zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der ROCK-Signalkette bei den Vernarbungsaktivitäten der HTFs in vitro mittels H-1152P untersucht, eines wirksamen und spezifischen Inhibitors der ROCK. Es zeigte sich, dass sich die Proliferation um 80-90% in den Zellen, die mit 10 µM des Inhibitors für 4 Tage inkubiert wurden, reduzieren ließ. H-1152P führte zu einem dosis-abhängigen Abbau der Stressfasern ohne toxische Wirkungen auszuüben und wies keine deutliche Interferenz mit der Proteinkinase A (PKA)-Signalkette auf. H-1152P bewirkte weiterhin eine 3,5-fache Verminderung der Zellmigration, eine 5-fache Senkung der Kontraktion einer Kollagenmatrix und eine dosis-abhängige Beeinträchtigung im Aufbau des Fibronektinnetzwerks. Diese Befunde weisen auf die Bedeutung der ROCK für die Vernarbung hin und betonen das Potenzial von H-1152P als nicht-toxischer Hemmstoff bei unerwünschten Wundheilungsaktivitäten.

Zahlreiche pro-apoptotische Signale aktivieren die ROCK-Signalkette. Eine H-1152P-vermittelte Hemmung der ROCK bietet sich daher als neue Strategie an, um das Überleben der RGZs beim Glaukom zu fördern. Ihre Wirksamkeit wurde zunächst in Organkulturen der Mausretina untersucht, in denen durch Serumentzug Zelltod insbesondere in der Ganglienzellebene induziert wurde. Inkubation mit 1 µM H-1152P verringerte das Ausmaß des Zelltods in allen retinalen Schichten deutlich ohne die PKA-Signalkette zu beeinflussen. Die Aktivierung der Astrozyten, Müllerzellen und Mikroglia wurde ebenfalls durch die Behandlung mit H-1152P stark abgeschwächt. Weiterhin wurde die Freisetzung pro-inflammatorischer Cytokine wie Interleukin (IL)-3, IL-6, Interferon-gamma, und TNFalpha signifikant reduziert, worauf die zu beobachtende verminderte Toxizität der Kulturüberstände zurückzuführen sein könnte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die neuroprotektive Wirkung der ROCK-Hemmung auf retinale Zellen durch eine verminderte Gliazellreaktivität und den daraus resultierenden Sekundärschäden bedingt sein könnte.

Eine direkte Wirkung der H-1152P-Behandlung auf RGZ wurde an einer transformierten Ganglienzelllinie der Ratte (RGC-5) analysiert. Unter Serumentzug übte 1 µM H-1152P eine direkte anti-apoptotische Wirkung aus. Jedoch führten höhere Konzentrationen (10-20 µM) zu einer drastischen Zunahme in der Anzahl onkotischer Zellen, die aufgrund einer beachtlichen Volumenzunahme im Zelltod endeten. Diese stark kontrastierenden Wirkungen von H-1152P beruhen vermutlich auf Unterschieden zwischen transformierten RGC-5 Zellen und den primären RGZ. Weitere Untersuchungen könnten nützliche Informationen bezüglich der Mechanismen der Onkose erbringen.

Um die neuroprotektive Wirkung von H-1152P auf RGZ in vivo zu untersuchen wurde eine Sehnervquetschung (SNQ) in Ratten durchgeführt. Die intravitreale Injektion von 1 µM H-1152P führte zu einer 1,6-fachen Zunahme in der Anzahl lebender RGZ verbunden mit einer verminderten Reaktivität der Gliazellen 7 Tage nach SNQ. Die Befunde unterstützen die Hypothese, dass die Abschwächung der reaktiven Gliose in gewissem Maße Sekundärschaden verhindert und das Überleben der RGZ nach Verletzung des Axons fördert. Diese Daten zeigen die Rolle der ROCK-Kaskade in verschiedenen am Glaukom beteiligten Zellen auf und betonen das therapeutische Potenzial der H-1152P-abhängigen ROCK-Hemmung als eine aussichtsreiche Maßnahme nicht nur um die unerwünschten Wundheilungs-aktivitäten der Tenonfibroblasten zu unterdrücken, sondern auch um den weiteren Verlust der RGZ zu verhindern.