Ca2+-Kanäle in cochleären Haarsinneszellen von Maus und Ratte : Entwicklungsgang der Ca2+-Ströme und molekulare Zusammensetzung

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-30061
http://hdl.handle.net/10900/45102
Dokumentart: Dissertation
Date: 2007
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Knipper, Marlies (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2007-07-26
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Calciumkanal , Cochlea , Patch-Clamp-Methode , Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion , Entwicklung
Other Keywords: Haarsinneszellen , Kanal-Untereinheiten
voltage dependent Calcium channel , cochlea , hair cells , development , electrophysiology
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Inhaltszusammenfassung:

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der Ca2+-Kanal-Ströme in äußeren Haarsinneszellen (ÄHZ) des neonatalen (postnataler Tag 1 (P1) - P8) und ausgereiften (P9 - P28) Cortischen Organs von Mäusen und Ratten charakterisiert und denen der inneren Haarsinneszellen (IHZ) gegenübergestellt. In ÄHZ wurden vor und nach Hörbeginn (P12) Ca2+-Kanal-Ströme gemessen, die aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber dem L-Typ-Kanal-Agonisten Bay K 8644 und dem L-Typ-Kanal-Antagonisten Nifedipin als L-Typ-Kanäle identifiziert werden konnten. Der Ca2+-Kanal-Strom war in ÄHZ von CaV1.3-/- -Mäusen auf 3 % des Kontrollwerts reduziert und der verbleibende Reststrom konnte durch Bay K 8644 nicht vergrößert werden. Da die reifen ÄHZ der Mäuse in den üblicherweise verwendeten Extrazellulärlösungen äußerst instabil waren und anschwollen, wurden neue Lösungskombinationen mit dem Zusatz von Tamoxifen oder der Substitution von Cl- durch Laktobionat entwickelt. Zudem wurden elektrophysiologische Messungen an den robusteren und größeren ÄHZ der Ratte durchgeführt. Sowohl in IHZ als auch in ÄHZ der Ratte wurde eine entwicklungsabhängige Regulation des Ca2+-Kanal-Stroms beobachtet. Ein Maximum der Barium-Strom (IBa)-Amplitude in ÄHZ wurde um P1-P4, in IHZ um P9-P11 erreicht. In ausgereiften Altersstadien verblieb der IBa auf niedrigem (ÄHZ) und mittlerem (IHZ) Niveau. Sowohl in inneren als auch in äußeren HZ fließt der Großteil des Ca2+-Stroms durch CaV1.3-Kanäle. Dennoch weichen die elektrophysiologischen Eigenschaften der IHZ leicht von denen äußerer HZ ab. Beispielsweise zeigen Ca2+-Kanal-Ströme in IHZ während lang anhaltender (300 ms) Depolarisationen eine etwas stärkere spannungsabhängige Inaktivierung (voltage dependent inactivation, VDI) als in ÄHZ. Auch die Strom-Spannungs-Kurven weisen mit abweichenden V½ und Vmax auf gewisse Unterschiede der Kanäle in beiden Haarzelltypen hin. Spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle bestehen aus vier verschiedenen Untereinheiten: einer transmembranären alpha1-Untereinheit, die die Pore bildet und den Spannungssensor trägt, einer intrazellulären beta-Untereinheit (CaVbeta) und den membranständigen Untereinheiten gamma und alpha2delta. Um zu überprüfen, ob die geringfügigen Abweichungen der elektrophysiologischen Kanaleigenschaften in IHZ und ÄHZ auf unterschiedliche Kombinationen des Kanals aus alpha1- und beta-Untereinheit zurückzuführen ist, wurde mittels RT PCRbeta spezifische mRNA im Cortischen Organ und auch in IHZ- und ÄHZ detektiert. Im Widerspruch zu Green et al. (Green et al., 1996) ließen sich im Cortischen Organ alle 4 bekannten beta-Untereinheiten des spannungsgesteuerten Ca2+ Kanals nachweisen. Auch in ÄHZ gelang die Amplifikation aller 4 beta spezifischen Fragmente. In IHZ dagegen ließen sich molekularbiologisch CaVbeta1, CaVbeta2 und CaVbeta3 nachweisen, jedoch nicht CaVbeta4. Die direkten Auswirkungen des Fehlens einer einzelnen beta-Untereinheit wurden durch elektrophysiologische Messungen der Ca2+-Kanal-Ströme in IHZ und ÄHZ von CaVbeta3-/- und CaVbeta4 -/- Mäusen im Vergleich zu den jeweiligen Wildtyp (WT) Strömen analysiert. Hierbei wurden Parameter wie Maximalamplitude des Ca2+-Kanal-Stroms (Imax), halbmaximale Aktivierung (V½), der Steigungsfaktor der Boltzmann-Funktion (k) sowie die Zeitkonstante der Aktivierung und der Grad der Inaktivierung bestimmt: In ÄHZ der CaVbeta3 -/- Mäuse führte das Fehlen dieser beta-Untereinheit zu einer signifikanten Abnahme der Stromamplitude, zu einer Verschiebung von k und zu einer Zunahme der spannungsgesteuerten Inaktivierung des Kanals. In IHZ dagegen führten der Verlust von CaVbeta3 sowie das Fehlen von CaVbeta4 zu einer signifikant schnelleren Aktivierungskinetik. In neonatalen IHZ der CaVbeta4 -/-Mäuse waren zudem V½, k und die Membrankapazität im Vergleich zu den WT-Zellen verändert: ÄHZ zeigten nach Verlust von CaVbeta4 eine Verschiebung des Boltzmann-Parameters k und eine verlangsamte Kinetik der Kanalaktivierung. Diese Ergebnisse sprechen für eine Beteiligung von CaVbeta3 und CaVbeta4 am Aufbau der CaV1.3-Kanäle sowohl in IHZ als auch in ÄHZ. Sie sind jedoch für die Kanal- und Hörfunktion nicht essentiell.

Abstract:

In this work we characterized the electrophysiological and pharmacological properties of Ca2+ channel currents in outer hair cells of the neonatal (postnatal day 1 (P1)-P8) and mature (P9-P28) organ of Corti in mice and rats in comparison to inner hair cells. The measured Ca2+ channel currents in outer hair cells before and after the onset of hearing (P12) could be identified as L-type-channels because of their sensitivity to the L-type-channel agonist Bay K 8644 and the L-type-channel antagonist nifedipine. In outer hair cells of CaV1.3-/- mice the Ca2+ channel current was reduced to 3% of the control and the persisting current could not be increased by Bay K 8644. Due to the fragility of the murine mature outer hair cells which showed swelling in the normally used extracellular solutions we developed solutions with tamoxifen or lactobionate instead of Cl-. Additionally electrophysiological recordings of the more stable outer hair cells of rat were performed. Both inner and outer hair cells of rat showed an age-dependent regulation of the Ca2+ channel currents with maximal amplitudes of barium currents around P1-P4 in outer and around P9-P11 in inner hair cells. The barium current amplitude remained on a low (outer hair cells) and medial (inner hair cells) level. In outer hair cells as well as in inner hair cells the main part of the Ca2+ current is carried by CaV1.3 channels. However the electrophysiological properties of both hair cell types show slightly differences. For instance Ca2+ channel currents in inner hair cells exhibit stronger voltage dependent inactivation during long lasting depolarization (300 ms) than outer hair cells. Also the differences of current-voltage-relationships (V1/2 and Vmax) suggest certain distinctions between both types of hair cells. Voltage dependent Ca2+ channels are composed of four different subunits: one transmembrane alpha1-subunit which forms the pore and contains the voltage sensor, one intracellular beta-subunit and the membrane-related gamma- and alpha2delta-subunit. To verify if the tiny discrepancies of the electrophysiological channel properties of inner and outer hair cells are due to different combinations of alpha1- and beta-subunit we demonstrated beta-specific mRNA in the organ of Corti and in inner and outer hair cells by RT-PCR. In contrast to Green et al. (1996) we could show mRNA of all known four beta-subunits of the voltage dependent Ca2+ channel in the organ of Corti. In outer hair cells, too we were able to amplify all four beta-specific fragments whereas in inner hair cells we could only show beta1, beta2 and beta3, but not beta4 on this level. We measured Ca2+ channel currents in inner and outer hair cells of CaVbeta3-/- and CaVbeta4-/- mice compared to wildtype littermates respectively to test the effect of lacking one single beta-subunit. Parameters like the maximal amplitude of the current (Imax), the halfmaximal activation (V1/2), the slope factor of the Boltzmann function (k) as well as the time constant of activation and the degree of inactivation were analyzed: In outer hair cells the lack of beta3 resulted in a significant decrease of the current amplitude, a shift of k and an increase of the voltage dependent channel inactivation. In contrast in inner hair cells the lack of beta3 and also of beta4 yielded in a significant acceleration of activation. Additionally V1/2, k and the membrane capacitance of neonatal inner hair cells of CaVbeta4-/- mice were affected.

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