Autologer vitaler Hautersatz für die Behandlung chronischer Wunden

Abstract

Die Behandlung chronischer Wunden stellt derzeit noch ein großes Problem in der Klinik dar. Verschiedene Hautersatz-Systeme stehen für unterschiedlichen Behandlungszwecke zur Verfügung. Aufgrund der biologischen Eigenschaften werden hierbei häufig Kollagenmatrizes mit oder ohne Zellbesiedelung für die Behandlung chronischer Wunden und/oder Verbrennungswunden verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene zellbiologische Ansätze zur Wechselwirkung von Progenitorfibroblasten bzw. Funktionsfibrozyten mit primären Keratinozyten sowie zur Entwicklung eines optimierten zellbesiedelten 3D-Trägersystems für den biologische Hautersatz (Composite) auf ihr Funktionieren im Sinne der Ausbildung einer strukturierten Epithelialisierung unter in vitro Bedingungen überprüft. Als 3D-Träger wurde MatriDerm, ein Kollagen-Elastin Träger verwendet und nach Vorbesiedelung mit Progenitorfibroblasten, mit Funktionsfibrozyten, bzw. mit einer in vivo relevanten Mischung der beiden Zelltypen sowie Aufsaat von Keratinozyten hinsichtlich der Ausbildung eines histologisch strukturierten, organtypischen Hautäquivalents analysiert.

Die Analyse der Wechselwirkung von Fibroblasten und Keratinozytenpopulationen ergab, dass eine 2:1-Mischung aus SFM:DMEM-Wachstumsmedium ohne Serumzusatz für die Kultur sowohl der Keratinozyten als auch Progenitorfibroblasten verwenden kann und dass das Proliferationsverhalten von primären Keratinozyten signifikant von Funktionsfibrozyten unterstützt wird. Mittels realtime PCR bzw. ELISA-Technik konnte nachgewiesen werden, dass Funktionsfibrozyten im Vergleich mit Progenitorfibroblasten der entscheidende Zelltyp bzgl. der Produktion des Keratinozyten-Wachstumsfaktors KGF sind.

Bzgl. der optimierten Bedingungen zur Herstellung von zellbesiedelten 3D-Compositen konnte festgestellt werden, dass Keratinozyten auf einem mit reinen Progenitorfibroblasten oder einer Mischung aus Progenitorfibroblasten und postmitotischen Fibrozyten (2:1) besiedelten MatriDerm-Träger in vitro innerhalb von 15 Tagen eine normal strukturierte, differenzierte und funktionsfähige in einer luftexponierte 3D-Kulturbedingung ausbilden. Dies konnte mit dem Nachweis von Differenzierungsmarker wie Pan-cytokeratin und Involucrin für die Epithelialisierung bzw. Kollagen Typ IV und Laminin-5 für Basallamina-Strukturen nachgewiesen werden. Dementsprechend kann gefolgert werden, dass die Verwendung von Progenitorfibroblasten bzw. einer in vivo relevanten 2:1 Mischung von Progenitorfibroblasten und Funktionsfibrozyten gegenüber herkömmlichen Systemen deutlich Vorteile in der Ausbildung eines organstypischen Hautäquivalents hat.

The treatment of chronic wounds still is a clinical problem. Diverse skin replacements systems are available for different purposes of treatment. Due to its biological properties collagen matrices seeded or non-seeded with cells are often used for the treatment of chronic wounds and burn wounds.

In this work different studies have been performed to analyze the interaction between progenitor fibroblasts and postmitotic fibrocytes with human primary keratinocytes in order to optimize an autologous human skin graft (composite). Hence the epithelialization on carrier matrices was analyzed under in vitro conditions. MatriDerm, a collagen elastin matrix was used as 3D carrier and preseeded with progenitor fibroblasts, postmitotic fibrocytes or a ratio of 2:1 progenitor fibroblasts : postmitotic fibrocytes, representing an in vivo mixture of both cell types. After the addition of primary keratinocytes to the thus pre-treated matrix, the formation of a histological structured organotypic skin equivalent was analyzed. The analysis of the interaction of progenitor fibroblasts and postmitotic fibrocytes with primary keratinocytes showed that a mixture of Serumfree Keratinocyte Medium SFM:Dulbeccos Modified Eagles Medium DMEM in the ratio 2:1 can be used without fetal calf serum for the cultivation of all cell types. It could be demonstrated that the proliferation of primary keratinocytes was significantly supported by postmitotic fibrocytes. By means of realtime RT-PCR and ELISA experiments it was shown that the keratinocyte growth factor KGF was produced in significantly higher amount by postmitotic fibrocytes compared to progenitor fibroblasts.

Concerning the optimal conditions for the establishment of a cell seeded 3D composite it could be shown that after 15 days in culture keratinocytes with progenitor fibroblasts or keratinocytes with progenitor fibroblasts : postmitotic fibrocytes in 2:1 ratio form a properly structured, differentiated and functional epithelia in an air exposed culture on MatriDerm. This was shown by histological staining with differentiation markers like pan-cytokeratine and involucrine (epitheliazation) as well as collagen IV and laminin-5 (basement membrane formation). Hence it can be concluded that the in vivo ratio of 2:1 progenitor fibroblasts : postmitotic fibrocytes shows obvious advantages in the construction of functional composites compared to conventionally used cell systems.