Untersuchung zur Induktion der Expression des Resistenz-vermittelnden MDR1-Effluxpumpen-Gens bei Candida albicans

Abstract

Im Gegensatz zu den übertragbaren Resistenzmechanismen von Bakterien spielen in der Resistenzentwicklung gegen Fluconazol bei Candida albicans die Expression natürlicher Transport-Systeme wie MDR1 eine dominierende Rolle. Patienten mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung invasiver Mykosen erhalten in der Regel aufgrund ihrer Grunderkrankungen eine Vielzahl von chemotherapeutischen Medikamenten (Antibiotika, Antiparasitika, Zytostatika u.a.). Es wäre denkbar, dass durch therapeutischen Einsatz dieser Substanzen bei mit C.albicans besiedelten Patienten eine Expression von Transportsystemen induziert wird, die sekundär Fluconazol-Resistenz auslösen. Es war Ziel dieser Arbeit, ein breites Spektrum an Substanzen, die klinisch bei Risikopatienten eingesetzt werden, auf ihr Potenzial zur Induktion von MDR1 in C. albicans zu prüfen. Für die Austestung der Reagenzienpalette (3 Antimykotika, 5 Antiparasitika, 7 Antibiotika) wurde ein Fluoreszenz-Induktionsassay etabliert, der auf zwei C. albicans Reporterstämmen basierte, bei denen jeweils auf einem Allel unter die Kontrolle des MDR1 Promotors ein GFP-Gen (grün fluoreszierendes Protein) gesetzt worden war. Von allen Testsubstanzen zeigte nur Rifampicin einen Induktionseffekt. Die MDR1-Induktion wurde durch RT-PCR bestätigt und mittels FACS-Analyse quantifiziert. Im Vergleich zu dem bekannten MDR1-Induktor Benomyl wies Rifampicin bereits in niedrigen Konzentrationen von 5-10 µg/mL einen induzierenden Effekt auf. Diese Expression von MDR1-spezifischer RNA war bereits nach wenigen Minuten nachweisbar und zeigte eine deutliche dosisabhängige Steigerung. Trotz Expression von MDR1-spezifischer RNA konnten in einer Kombinationstestung von Fluconazol und Rifampicin bis 40 µg/mL keine erhöhten MHK-Werte für C.albicans gezeigt werden. Obwohl in vitro keine resistenzauslösende Wirkung belegt werden konnte, zeigte sich doch ein deutlicher Effekt eines Antibiotikums auf die Genexpression des Sprosspilzes C. albicans. Ob dieses Phänomen in vivo von Bedeutung ist, muss in zukünftigen Arbeiten geprüft werden. Es wäre dabei auch ein interessanter Aspekt, die Wirkung von Rifampicin auf die Genexpression bei C. albicans und anderen humanpathogenen Pilzen über Resistenzgene hinaus zu untersuchen. Letzendlich ist nicht auszuschließen, dass sich mit der Entwicklung neuer Medikamente z.B. für die Behandlung von Infektionen immunsuppremierter Patienten auch neue Forschungsansätze in der Mykologie ergeben.

In Candida albicans, overexpression of natural transport systems such as the efflux pump MDR1 are the most important mechanisms contributing for resistance to fluconazole. Patients with an increased risk for invasive candidiasis (e.g. AIDS patients) are frequently treated with diverse antibiotic, antiparasitic and/or cytostatic drugs either as prophylactic or therapeutic agents. Therefore, it could be assumed that in vivo some of these drugs could influence the expression of efflux pump genes in colonizing C. albicans strains and that this upregulation of efflux pump genes might result in fluconazole resistance. It was the aim of the presented study to investigate the potential of clinically relevant drugs to affect MDR1 expression in C. albicans in vitro. We established a fluorescence induction assay by using two C. albicans reporter strains. In these strains a gfp gene (green fluorescent protein) was set under the control of the native MDR1 promoter in one allel each. Detection of green fluorescent Candida cells by fluorescence microscopy was an indicator for MDR1 promoter activation and subsequent gfp production. Of 15 compounds tested including 3 antimycotics, 5 antiparasitics and 7 antibiotics, only rifampicin showed a gfp inducing effect. MDR1 transcription was confirmed by RT-PCR and was quantified by FACS analysis. Compared to benomyl, a known inducer for MDR1 expression, rifampicin induced MDR1 transcription even in concentrations as low as 5-10 µg/mL. This expression of MDR1 specific RNA was found already after a few minutes and was dose depending. Despite demonstration of an increased MDR1 expression, minimal inhibitory concentrations (MICs) of fluconazole were not affected by rifampicin concentrations up to 40 µg/mL. Although failing to produce fluconazole resistance in vitro, it is remarkably that an antibiotic agent could affect gene expression in the yeast Candida albicans. The clinical relevance of this phenomenon in vivo has to be investigated by further studies. It would also be a quite interesting aspect to analyse the effect of rifampicin on expression of genes other than genes responsible for antifungal resistance in Candida albicans as well as in other human fungal pathogens.