Vergleich verschiedener Methoden zur Amplifikation und Detektion von Aspergillus-DNA im Blut von Patienten mit empirischer AmBisome-Therapie

Abstract

Invasive Aspergillusinfektionen sind zu einem großen Teil mit einer hohen Rate an Morbidität und Mortalität verbunden. Besonders gefährdet sind immunsupprimierte Patienten nach Hochdosis Chemotherapie und nach Knochenmarktransplantation. Die definitive Diagnose einer Aspergillose erfordert den zyto- oder histopathologischen Nachweis von Hyphen, sowie den kulturellen Erregernachweis, was allerdings selten gelingt. Zur Diagnose von Aspergillusinfektionen werden immer häufiger nicht invasive Methoden eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 3 verschiedene Methoden zum Nachweis von Aspergillus-DNA im Blut von immunsupprimierten Patienten retrospektiv in der PCR-ELISA analysiert. Proben bei denen Aspergillus-DNA nachgewiesen werden konnte, wurden im Light-Cycler-System quantitativ ausgewertet und schließlich mit den DNA Detection Test Strips untersucht. Die Probennahme erfolgte zweimal pro Woche bis zum Tag 100 nach Transplantation. Die DNA-Extraktion wurde an EDTA antikoagulierten Blutproben durchgeführt unter Verwendung von QIAamp DNA Mini Kit von QIAGEN, Proteinase K von Roche Diagnostics und rekombinanter Lyticase von SIGMA. Zum Ansatz einer PCR werden 10µl extrahierter Aspergillus-DNA und 40µl PCR-Mastermix, zusammengesetzt aus 25,7µl H2O, 5µl 10x PCR-Puffer, 2µl MgCl2, 5µl dig-DNTP, 20µl Primers und 0,3µl Taq-Polymerase, benötigt. Eine PCR bestand aus 34 Zyklen und jeder Zyklus wurde aus 30s Denaturierung bei 94°C, 1min Annealing bei 62°C und 2min Extension bei 72°C aufgebaut. Zur Detektion des digoxigenin-markierten PCR-Produktes wird nun das PCR-ELISA(DIG-Detection) Kit von Roche eingesetzt. Positive und negative Proben wurden eingesetzt um eine eventuelle Kontamination zu detektieren. Zum Ansatz einer Light-Cycler-PCR werden 5µl extrahierter Aspergillus-DNA und 15µl Mastermix, zusammengesetzt aus 3,6µl H2O, 2,4µl MgCl2, 1µl Primer, 0,5µl Fluoreszein, 0,5µl LC Red 640 und 2µl LC-FastStart-Enzym, benötigt. Eine Light-Cycler-PCR bestand aus 45 Zyklen und jeder Zyklus wurde aus 3s Denaturierung bei 95°C, 15s Annealing bei 54°C, 20s Scherzkurve bei 50°C und 3min Abkühlphase bei 40°C aufgebaut. Das Verfahren wurde unter Verwendung von Light-Cycler-FastStart DNA Mater Hybridization Probes Kit von Roche durchgeführt. Für den Nachweis von Aspergillus-DNA mit den DNA Detection Test Strips von Boehringer-Mannheim werden 4,5µl digoxigenin-markiertes PCR-Produkt hybridisiert mit 0,5µl biotin-markierten Oligonukleotiden benötigt. Bei 1 Patienten (3,5%) wurde die Diagnose der invasiven Aspergillose am Tag 5 nach Stammzelltransplantation gestellt. Die PCR-ELISA fiel zweimal (am Tag 20 und 36) positiv auf. Eine Therapie mit AmBisome lief seit Tag 5. Der Patient verstarb innerhalb des Beobachtungszeitraums, am Tag 54. Bei 6 Patienten (22,5%) wurde der klinische Verdacht auf Aspergillose gestellt. Bei 3 Patienten erfolgte der DNA-Nachweis vor Verdachtsstellung einer Aspergillose. Bei 1 Patienten konnte Aspergillus-DNA in der PCR-ELISA mehrmals nachgewiesen werden. 12 Patienten ohne dokumentierte Aspergillose hatten intermittierend positive Ergebnisse in der PCR. 4 von denen erhielten AmBisome bei persistierendem Fieber in Neutropenie. Die insgesamt 31 Proben, bei denen die Aspergillus-DNA in der PCR-ELISA nachgewiesen werden konnte, wurden weiter im Light-Cycler-System auf Aspergillus-DNA untersucht. Von den 31 Proben waren in diesem zweitem Verfahren 3(10%) positiv und 28(90%) negativ. Im Gegensatz zu PCR-ELISA konnte in diesem Verfahren keine Aspergillus-DNA bei dem Patienten mit invasiver Aspergillose nachgewiesen werden. 2 Proben von 2 Patienten mit Verdacht auf Aspergillose waren auch im Light-Cycler positiv. 1 Patient ohne nachgewiesene Aspergillose hatte in diesem Verfahren ein positives Ergebnis. Aspergillus-DNA konnte mit den DNA Detection Test Strips bei Patienten mit dokumentierter Aspergillose nachgewiesen werden. 3 Proben von 1 Patienten mit Verdacht auf Aspergillose waren auch positiv in diesem dritten Nachweisverfahren. Zu einem positiven Ergebnis kam es auch bei 2 Patienten ohne nachgewiesene Aspergillose. Obwohl dieses Testverfahren ohne großem Aufwand den schnellen Nachweis von Aspergillus-DNA erlaubte, entsprach es im Allgemeinem, im Bezug auf Sensitivität und Spezifität nicht dem Standard. Das PCR-ELISA-Verfahren ist durch eine hohe diagnostische Sensitivität (100%) und eine geringe Spezifität (35,7-45,55%) charakterisiert. Der prognostische Wert der positiven Proben war mit 5,3% für eine nachgewiesene invasive Aspergillose und 33% für eine mögliche Infektion relativ gering. Der negative Vorhersagewert dagegen betrug in beiden Fällen 100%. PCR-ELISA stellt ein einfaches, nicht invasives und reproduktives Testverfahren dar. Es gibt zwei potentiell wichtige Probleme bei der Interpretation der PCR-ELISA-Ergebnisse. Erstens die Signifikanz einzelner positiver Ergebnisse und zweitens die intermittierend positiven Ergebnisse. Ein einziges positives Resultat ist nicht aussagekräftig. Außerdem können ein oder mehrere negative Ergebnisse eine invasive Aspergillose nicht definitiv ausschließen. Diese Ergebnisse können aber zusammen mit anderen diagnostischen Verfahren (z.B. CT, Röntgen-Thorax) dazu beitragen Hochrisikopatienten rechtzeitig zu erkennen und erfolgreich zu therapieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass PCR-ELISA ein sensitiveres Nachweisverfahren im Vergleich zu Light-Cycler und DNA Detection Test Strips darstellt. Trotzdem könnte Light-Cycler wertvoll bei der Quantifikation von klinischen Proben sein und erfolgreich zur Diagnose von Infektionen eingesetzt werden, deren Erreger kulturell schwer nachzuweisen sind.

Invasive aspergillosis is an increasingly common disease among immunocompromised patients. It has become a major morbidity and mortality factor in patients undergoing stem cell transplantation and in those treated with high dose chemotherapy. Definite proof of invasive aspergillosis implies the cytological and histopathological detection of hyphal invasion and a positive blood culture for aspergillus. The increased infection rate necessitates the improvement of non-invasive diagnostic methods in order to achieve early detection of the disease. We performed a retrospective randomised study to compare three methods for the detection of aspergillus DNA. A total of 507 whole blood samples from 29 immunocompromised patients after stem cell transplantation were analysed using a PCR-ELISA assay. Samples that showed positive results in this assay were further tested with the LightCycler assay and with the DNA Detection Test Strips. Blood samples were collected twice per week until day 100 after stem cell transplantation. DNA extraction of 5ml EDTA-anticoagulated whole blood specimens was performed using the QIAamp DNA Mini kit from QIAGEN, proteinase K from Roche Diagnostics and recombinant lyticase from SIGMA. PCR was performed on 10µl of extracted DNA, which was amplified in 40µl reaction mix containing 25, 7µl of sterile H2O, 5µl of 10x PCR buffer, 2µl of MgCl2, 5µl of digoxigenin labeled nucleotides, 20µl of primers and 0, 3µl of Taq polymerase. 34 cycles of repeated denaturation (30s, 94°C), annealing (1min, 62°C) and extension (2min, 72°C) were applied. For the detection of PCR product we used the PCR ELISA (DIG Detection) Kit from Roche. Positive and negative probes were used in order to control contamination. LightCycler was performed on 5µl of extracted DN A amplified with 15µl Mastermix containing 3,6µl sterile H2O, 2,4µl MgCl2, 1µl of primer, 0,5µl of hybridization probe labeled with LC Red 640, 0,5µl of fluorescein and 2µl of LC-FastStart-Enzyme. 45 Cycles of repeated denaturation (3s, 95°C), annealing (15s, 54°c) and melting curve (20s, 50°C) were performed. For this assay we used the LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit from Roche. The third diagnostic method used was the DNA Detection Test Strips from Boehringer-Mannheim. The assay was performed with 4, 5µl digoxigenin-labeled PCR product, hybridized to a biotin-labeled oligonucleotide. 1 patient (3.5%) developed invasive aspergillosis. It was diagnosed 5 days after stem cell transplantation. He received intravenous treatment with Amphotericin B. The patient was found to be PCR positive for aspergillus DNA under antifungal therapy twice (day 20 and 36 after stem cell transplantation) and died 54 days after stem cell transplantation. 6 patients (22.5%) were diagnosed with probable aspergillosis. In 3 of them the PCR results were positive before diagnosis was made. In our data set, only 1 patient had more than 1 positive PCR results. 12 patients had intermittent PCR positive results without prove of disease. Only 1 of them received antifungal therapy. 11 patients had no PCR positive results and none were diagnosed with aspergillosis. 4 of them received therapy because of persisting febrile Neutropenie. 31 whole blood samples from 19 patients showing positive results in the PCR ELISA assay were additionally tested with the LightCycler assay. Among these, 3 (10%) were LightCycler positive, 28 (90%) negative. In contrast to PCR ELISA, no aspergillus DNA could be detected with the LightCycler assay in one patient with proven infection. 2 samples from 2 patients with probable infection were in LightCycler positive. 1 patient without proof of infection had a positive result in this assay. Compared to PCR ELISA assay, the LightCycler assay shows a less sensitive rate in the detection of invasive aspergillosis. When testing the 31 samples with the DNA Detection Test Strip, only 6 were positive. aspergillus DNA was detected with the DNA Detection Test Strip in 1 sample from the patient with proven invasive aspergillosis. 3 samples from a patient with probable aspergillosis were also found to be positive in this assay. Further aspergillus DNA could be detected in 2 samples from 2 different patients without proven or probable aspergillosis. Although this assay could allow the rapid detection of aspergillus DNA, its specifity and sensibility was not according to standard. ELISA-PCR was the most sensitive (100%) but with a low specifity (35.7-45.55%) method in early detection of the infection. The positive predictive value was 5,3% for invasive aspergillosis and 33% for a probable aspergillosis. The negative predictive value was either for a proven or for probable aspergillosis 100%.

The correct interpretation of the PCR positive results is of crucial importance. Single PCR-tests performed on whole blood without further diagnostic tests are not a proof for invasive aspergillosis. Nevertheless, in combination with further diagnostic investigation (i.e. clinical signs, CT-Scans, chest X-rays) they help to early detect the disease. It is not only important to detect but also to quantify rapidly, specifically and sensitively aspergillus DNA. We could show the PCR ELISA assay was the most sensitive method in early detection of the infection, though its specifity was low. Nevertheless, it may be helpful to use LightCycler for the quantification of the fungal burden in clinical samples or in cases where the cultural detection is not possible. The DNA Detection Test Strips allowed the rapid detection of aspergillus DNA, but its specifity and sensibility was not according to commonly agreed standards.