Expressionsveränderung des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 auf Leberendothelzellen unter Hypoxie und Reoxigenierung

Abstract

Die Lebertransplantation stellt seit einigen Jahren ein etabliertes therapeutisches Verfahren bei einer Vielzahl von Lebererkrankungen, die zu einer terminalen Leberinsuffizienz führen, dar. Nachdem die Fragen der Indikation, Operationstechnik und Fragen der Immunsuppression weitgehend geklärt sind, sind immunologische Phänomene, die sich aus der Ischämie-Reperfusionsschädigung ergeben, weiterhin ungeklärt.

Durch Antigenpräsentation, gerichtete Einwanderung von Leukozyten ins Gewebe und zytokinvermittelte Entzündung kommt es zur Schädigung des Organs, die sich klinisch in Abstoßungsreaktion zeigt. Während der Organischämie werden die Weichen für die Entwicklung dieser Entzündung gestellt, die klinische Manifestation beginnt nach der Reperfusion des Organs.

In der vorliegenden Arbeit wurde am Modell der Endothelzellen aus Rattenlebern untersucht, welche Expressionsveränderung das Interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) in vitro unter Hypoxie und nachfolgender Reoxigenierung in der Normothermie erfährt. Zur Gewinnung nichtparenchymaler Leberzellen wurde ein Verfahren bestehend aus Kollagenaseverdau und anschließender Gegenstromzentrifugation angewandt. Im Mittel wurden 3,8 x 10^7 Endothelzellen und 2,7 x 10^7 Kupfferzellen pro Leber gewonnen. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie fand eine Zellcharakterisierung der einzelnen Fraktionen statt, die eine Reinheit > 90% aufwies. Die ICAM-1 Expression wurde bei einer normothermen Hypoxie über 6 Stunden mit anschließender Reoxigenierung über 1, 12 und 24 Stunden und gegen eine normotherme Kontrolle mittels eines fluoreszierendem Antikörper-Konjungates gemessen.

Auf nativen Endothelzellen der Leber bestand eine konstitutive Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1. Durch normotherme Hypoxie von 6 Stunden fiel die Expression auf 0,75 +/- 0,07 der konstitutiven Expression ab, die Kontrolle blieb unverändert. Die Expression von ICAM-1 der Kontrolle sank im weiteren Verlauf nach 30 Stunden kontinuierlich auf 0,46 +/- 0,05 ab.

Im hypoxischen Ansatz wurde nach einstündiger Reoxigenierung ein Dichteanstieg der ICAM-1-Expression auf 0,84 +/- 0,07, dieser Wert lag nur gering unter der Kontrolle (0,88 +/- 0,07). Nach 12 Stunden Reoxigenierung lag die Expression von ICAM-1 geringfügig über der Kontrolle und nach 24 Stunden Reoxigenierung geringfügig unter dem Kontrollwert.

Dieser Verlauf ist interessant, da in der Literatur in Studien an Biopsien bisher als Folge der Hypoxie (Ischämie) eine ansteigende ICAM-1-Expression beobachtet wurde, die sich durch Reoxigenierung (Reperfusion) noch deutlicher ausprägte.

Die hier vorgelegten Ergebnisse im Zellkulturmodell zeigen, dass die klinisch und im Tierexperiment beobachtete Hochregulation vom ICAM- 1 nicht autonom in Endothelzellen stattfindet sondern der Regulation durch Entzündungsmediatoren / entzündliche Infiltration unterliegen muss.

Nowadays liver transplantation is a standard therapy for a multitude of liver diseases leading to terminal liver failure. Despite indication, surgical technique and immunosuppressive therapy has been in the focus of research for many years, there are still unsolved immunological phenomenons due to ischemia and reperfusion injury.

Presentation of antigen, migration of leukocytes into the tissue and cytokines are leading to inflammation and consecutive to damage of the organ which is clinically manifested in transplant dysfunction and rejection of the organ. During ischemia of the organ a cascade of inflammation is started and then clinical manifestations become apparent after reperfusion of the organ.

In this study we investigated the expression of the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in an in vitro model of endothelial cells from rat livers in hypoxia and following reoxygenation in normotherme conditions.

For extraction of non-parenchymal cells we used a method consisting of enzymatic processing with collagenase and following countercurrent centrifugation. In the mean 3,8 x 10^7 endothelial cells and 2,7 x 10^7 Kupffer cells were extracted per liver. A cell characterization of every cell fraction was performed by flow cytometry, the degree of purity was >90%.

Expression of ICAM 1 was measured with a fluorescent antibody conjugate in hypoxia over 6 hours in normotherme conditions followed by a reoxygenation for 1, 12 and 24 hours and in a normotherme control.

On native liver endothelial cells a constitute expression of ICAM-1 was found. After normotherme hypoxia for 6 hours expression decreased from the constitute expression to 0,75 +/- 0,07, the control remained unchanged. However, after 30 hours in the control expression of ICAM-1 decreased continuousely to 0,46 +/- 0,05.

After one hour of reoxygenation in the hypoxemic approach an increase of ICAM-1 expression to 0,84 +/- 0,07 was seen, this was slightly lower than the control (0,88 +/- 0,07). After 12 hours of reoxygenation expression of ICAM-1 was slightly higher than the control and after 24 hours of reoxygenation slightly lower than the control.

Interestingly, studies on biopsies reported in the literature showed an increased ICAM-1 expression as result of hypoxia (ischemia), which was more clearly pronounced by reoxygenation (reperfusion).

Our data of the in vitro model show, that upregulation of ICAM-1 seen in clinical cases and in vivo experiments with animals is not an autonomous process in endothelial cells, but seems to depend on regulation through mediators of inflammation/ inflammatory infiltration.