Charakterisierung von Ionenkanal- und Tyrosinkinase-Inhibitoren hinsichtlich ihrer Wirkung auf die intrazelluläre Vermehrung von Legionellen

Abstract

Legionella (L.) pneumophila ist ein intrazelluläres Bakterium, das sich in alveolären Makrophagen vermehrt und die sogenannte "Legionäreskrankheit" verursacht. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK), wie auch der Einfluss von Ionenkonzentrationen, auf das intrazelluläre Wachstum dieser Erreger in MonoMac6-Zellen untersucht. In verschiedenen Versuchen wurde eine intrazelluläre Wachstumshemmung von L. pneumophila unter Einfluss des PTK-Inhibitors Genistein beobachtet. Untersuchungen mit einem anderen PTK-Inhibitor, Herbemycin, zeigten dagegen keinen Effekt auf das Wachstum von L. pneumophila. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden Versuche mit Genistein-Analoga, die inaktiv bezüglich der PTK-Inhibition sind, durchgeführt. Hierbei konnte eine Wachstumshemmung von L. pneumophila beobachtet werden. Anhand dieser Ergebnisse wurden weitere Effekte des PTK-Inhibitors Genistein auf die intrazelluläre Signaltransduktion, wie z.B. eine agonistische und antagonistische Wirkung auf Östrogenrezeptoren, sowie eine Hemmung verschiedener Ionenkanäle und -transporter, untersucht. Die Versuche zeigten, dass besonders Inhibitoren der L-type Calciumkanäle - Nifedipin, Verapamil und Diltiazem - und ein Inhibitor der Ryanodine Rezeptoren - Dantrolen - , der die Ausschüttung von Calcium aus intrazellulären Speichern steuert, das Wachstum von L. pneumophila hemmt. In weiteren Versuchen wurde mit Hilfe der Konfokalmikroskopie die intrazelluläre Calciumverteilung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass in uninfizierten Zellen das Calcium kompartimentiert ist, während in mit L. pneumophila infizierten Zellen das Calcium über den Intrazellulärraum verteilt ist. Diese Arbeit zeigt die Bedeutung des intrazellulären Calciumanstiegs während Infektion und Vermehrung von L. pneumophila. Die beobachtete Wachstumshemmung von L. pneumophila unter Genistein konnte nicht auf eine Hemmung der PTK zurückgeführt werden, vielmehr kann als die ursächliche Wirkung eine Hemmung der L-type Calciumkanäle vermutet werden.

Legionella (L.) pneumophila, an intracellular bacterium which replicates within human alveolar macrophages, causes a systemical infection - "Legionnaires Disease". In this work a potential influence of protein tyrosine kinases (PTK) on intracellular growth of L. pneumophila in Mono Mac 6-cells (MM6) was examined. Furthermore the influence of different intracellular ion-concentrations on growth and multiplication of L. pneumophila was examined. In several experiments intracellular growth inhibition of L. pneumophila under treatment with the PTK-inhibitor Genistein was noticed. Surprisingly experiments with another PTK-inhibitor, Herbimycin, showed that this PTK-inhibitor did not affect intracellular growth of L. pneumophila. According to these results, experiments with analogues of Genistein, which are inactive concerning the PTK-inhibition, were done. Here a distinct growth inhibition of L. pneumophila was observed. Based on these results it is assumed that PTK-inhibition was not responsible for the observed growth inhibition of L. pneumophila under treatmend with Genistein. Other known effects of Genistein on intracellular signal transduction, like function as estrogen receptor agonist and antagonist and the function as inhibitor of different ion channels and ion transporters, were tested. The experiments showed that especially inhibitors of l-type calcium channels - Nifedipin, Verapamil and Diltiazem - and an inhibitor of ryanodine receptors - Dantrolen - , which affect the calcium current of intracellular storages, caused a distinct growth inhibition of L. pneumophila. In further experiments by using confocal microscopy the intracellular calcium arrangement was examined. It was shown that in contrast to uninfected cells, where intracellular calcium was strictly clustered, in cells, which were infected with L. pneumophila, calcium was widely spread all over the cell. Finally, this work showed the importance of intracellular calcium increase during infection and multiplication of L. pneumophila. Calcium-concentrations also had an impact on growth inhibition of L. pneumophila under treatment with Genistein. The function of Genistein as an inhibitor of l-type calcium channels caused the observed growth inhibition of L. pneumophila.