Identifizierung und Quantifizierung von myo- und chiro- Inositol in Plasma und Erythrozyten von erstgradig Verwandten an Diabetes mellitus Typ 2 erkrankter Patienten

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Studie war, eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse der Isomere myo- und chiro- Inositol aus isolierten Erythrozyten- und Plasma- Proben durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie zu entwickeln. Die Vorbereitung und Derivatisierung der Proben wurde so optimiert, daß bei einfacher, relativ schneller und kostengünstiger Durchführung eine gute Sensitivität und Spezifität der Messungen erreicht werden konnten. Zur Quantifizierung der Inositole wurden die Ionen mit den Massenzahlen 115, 126 und 168 in Anlehnung an deren zuvor erhaltene Spektren benutzt. Zur Trennung von anderen Substanzen wurde das Ion mit der Massenzahl 217 benutzt, da sein Peak sich vergleichsweise niedrig bei Inositolen, jedoch hoch z.B. bei Glukose zeigte. Bei den isolierten Erythrozyten- Proben wurden die Unterschiede im Hämatokrit- Wert berücksichtigt. Zur Identifizierung und Quantifizierung des Internen Standards wurden die Ionen mit den Massenzahlen 85 und 140 benutzt. Zur Kalibirierung wurde jeder Probenserie ein Set von n=5 Proben mit definiertem Gehalt an Inositolen und Internem Standard vorausgeschickt. Es zeigte sich eine Korrelation bei myo- Inositol von r=0,9831 und bei chiro- Inositol von r=0,9972. Zur Validierung der Ergebnisse wurden n=10 Proben aus dem Routineprozeß des Zentrallaboratoriums der Universitätsklinik Tübingen aufgearbeitet und gemessen. Dabei zeigte sich für die Plasma- Proben ein Variationskoeffizient für myo- und chiro- Inositol von je 5%. Unter Berücksichtigung der variierende Hämatokrit- Werte zeigte sich für die Proben aus isolierten Erythrozyten ein Variationskoeffizient von 4% für beide Isomere. Die klinische Anwendung dieser Methode erfolgte im Rahmen der TüFF- Studie. Die Blutproben stammten von Verwandten ersten Grades von an Diabetes mellitus Typ 2 erkrankten Patienten. Der Gehalt an myo- und chiro- Inositol in n=133 Plasma- und n=136 isolierten Erythrozyten- Proben wurde gemessen. Der durchschnittliche Gehalt an myo- Inositol in isolierten Erythrozyten war signifikant höher als im Plasma ( 8,49 ± 0,23 µg/ml vs. 6,39 ± 0,17 µg/ml, p<0,001). Der durchscnittliche Gehalt an chiro- Inositol war ebenfalls in Erythrozyten- Proben hoch signifikant höher als in Plasma- Proben ( 0,131 ± 0,01 µg / ml vs. 0,086 ± 0,01 µg / ml, p= 0,002). Die Verhältnisse zwischen myo- und chiro- Inositol zeigten sich signifikant geringer bei isolierten Erythrozyten als bei Plasma ( 106,4 ± 6,4 vs. 172,0 ± 11,6, p< 0,001 ). In der Literatur finden sich Studien mit diskrepanten Ergebnissen, die Konzentrationen verschiedener Inositol- Isomere in Erythrozyten verglichen mit Plasma zeigten sich höher, etwa gleich hoch oder geringer. Untersuchungen des Gehaltes an chiro- Inositol in isolierten Erythrozyten sind bisher von anderen Arbeitsgruppen noch nicht publiziert worden. Manche Studien zeigen eine positive Korrelation zwischen dem Gehalt an Inositol und dem HbA1c- Wert, dem Auftreten von diabetischen Komplikationen, der Erkrankungsdauer oder der Nierenfunktion. Die vorliegende Studie führt eine Reihe anderer Untersuchungen von Inositol in unterschiedlichen Medien fort. Hierbei wurde zum ersten Mal eine Methode erarbeitet, die die Analyse von myo- und chiro- Inositol in extra- und intracellulären Medien erlaubt. Im Zusammenhang mit anderen Methoden ist es nun möglich, umfassende Untersuchungen von unterschiedlichen Inositol- Isomeren in Urin-, Plasma- und isolierten Erythrozyten- Proben bei unterschiedlichen Kollektiven durchzuführen. Die genauen biologischen Funktionen und der Metabolismus des Inositols ist noch nicht vollständig geklärt, die vorliegende Studie leistet jedoch einen wertvollen Beitrag zur qualitativen und quantitativen Analyse.

The aim of this study was to develop a method by using gas- chromatography and mass- spectrometry in order to quantitatively analyse the isomers myo- and chiro- Inositole from samples of isolated erythrocytes and plasma. The preparation and derivatisation of the samples could be optimized to a simple, price- worthy and relatively quick procedure. With the following measurements good sensitivity and specificy could be achieved. To quantify the Inositole- isomers the ions with mass 115, 126 and 168 were used, which were chosen according to their previously found spectra. To separate them from other substances as e.g. glucose and other sugar- alcohols and thereby to identify the Inositoles the ion with mass 217 was used, as it had a peak much higher in glucose than in Inositoles. While evaluating the samples of isolated erythrocytes one had to respect the differences in hematocrite. To identify and quantify the Internal Standard the ions with mass 85 and 140 were used. For proper calibration a set of n=5 samples of a defined content of each Inositole and Internal Standard was added to each set of samples. The correlation found in myo- Inositole was r=0.9831, in chiro- Inositole it was r=0.9972. To validate the results, a set of 10 samples of isolated erythrocytes and plasma from the routine laboratory process of the Tübingen University Hospital were prepared and measured. The plasma samples showed a variation coefficient of 5% for both myo- and chiro- Inositole. In isolated erythrocytes – regarding the different values of hematocrite- a variation coefficient of 4 % for both isomers was found. The clinical application of this method happened within the TüFF- study. Blood was taken from first- grade relatives of patients suffering from Diabetes type 2. The contents of myo- and chiro- Inositole in n=133 samples of plasma and in n=136 samples of isolated erythrocytes were measured. It showed, that the average content of myo- Inositole in isolated erythrocytes was significantly higher than in plasma ( 8.49 ± 0.23 µg / ml vs. 6.39 ± 0.17 µg / ml, p< 0.001). The average content of chiro- Inositole in isolated erythrocytes was highly significantly greater than in plasma ( 0.131 ± 0.01 µg / ml vs. 0.086 ± 0.01 µg / ml, p= 0.002). The relations between myo- / chiro- Inositole showed to be significantly lower in isolated erythrocytes than in plasma ( 106.4 ± 6.4 vs. 172.0 ± 11.6, p< 0.001 ). In literature studies with discrepant results show up, as the concentrations of different isomers of Inositole in erythrocytes compared to plasma were found to be higher, almost equal or lower. Examinations of the content of chiro- Inositole in isolated erythrocytes have not been published by other study- groups so far. Some studies show a correlation between the contents of Inositole and the values of HbA1c or complications caused by Diabetes and the duration of Diabetes. A correlation between the concentrations of Inositole and kidney- function was demonstrated. This study does not answer the question, if the relations between the different Inositoles in samples of isolated erythrocytes or plasma can be used to predict Insuline- resistance, as postulated by a different study- group using urine- samples. This study continues a couple of examinations of Inositole in different media. In this study a method was developed for the first time to measure myo- and chiro- Inositole in both extra- and intra- cellular media. In context with the methods developed before, it it now possible to perform comprehensive examinations of different isomers of Inositole from samples of urine, plasma and isolated erythrocytes within different populations. The exact biological functions and metabolism of Inositole has not been cleared completely yet, but this study offers a valuable path to its qualitative and quantitative analysis.