Mutationsanalyse des HFE-Genes mittels DHPLC bei Hämochromatose-Patienten und Parkinson-Patienten

Abstract

Bei der HFE-assoziierten Hereditären Hämochromatose (HH1) handelt es sich um ein monogen vererbtes Krankheitssyndrom, bei welchem es aufgrund von Sequenzvariationen im HFE-Gen zu einer exzessiven Eisenspeicherung mit folgender Schädigung diverser Organsysteme kommt. Die wichtigsten, mit dieser Erkrankung assoziierten Genotypen sind dabei die homozygote C282Y-Mutation in Exon 4, die homozygote H63D-Mutation in Exon 2 und die Compound-Heterozygotie für diese zwei Mutationen. Diese Genotypen können bei vielen Individuen, aber bei weitem nicht allen Individuen mit entsprechendem Phänotyp nachgewiesen werden. Auch bei der routinemäßig durchgeführten molekulargenetischen Analyse des hier untersuchten HH1-Kollektives konnte nur für einen Teil der insgesamt 116 Patienten ein entsprechender Genotyp festgestellt werden. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit alle 6 Exons des HFE-Genes innerhalb dieses Kollektives mittels DHPLC und Sequenzierung untersucht. Hierbei konnte das Vorliegen der zwei Hauptmutationen der HH1 als exonische missense-Mutationen und eine intronische Sequenzvariation (IVS2/3889*T>C) nachgewiesen werden, über deren Bedeutung noch keinerlei Klarheit besteht. Mit Hilfe einer Stammbaumanalyse konnte außerdem eine Kopplung der H63D-Mutation mit dieser intronischen Sequenzvariation festgestellt werden. Neben der genetischen Untersuchung wurde retrospektiv für jeden Patienten die vorliegende Klinik anhand eines Patientenbogens erhoben. So konnten Vergleiche zwischen dem vorliegenden Genotyp und Phänotyp durchgeführt werden. Hierzu wurden die Patienten, bei denen die drei wichtigsten Genotypen nachgewiesen worden waren, in drei Gruppen eingeteilt und deren Werte für die Eisenstoffwechselparameter, welche als Marker für das Vorliegen und die Schwere der Eisenüberladung dienen, untereinander verglichen. Dabei wurden die höchsten Werte für die homozygote C282Y-Mutation festgestellt, wie bereits in Anlehnung an andere Studien zu vermuten war. Eine Korrelation zwischen dem zugrundeliegenden Genotyp und der Schwere der Eisenüberladung konnte somit nochmals an dem hier gewählten Kollektiv bestätigt werden. Bezüglich der genetischen Untersuchung lässt sich zusammenfassend sagen, dass bei Verdacht auf eine HH1 die Untersuchung auf die zwei Hauptmutationen hin ausreichend erscheint, da im HFE-Gen das Vorliegen anderer Mutationen nur bei einem verschwindend geringen Anteil der Patienten angenommen werden kann. Es scheint eher sinnvoll, bei negativen Ergebnissen im HFE-Gen trotz entsprechender Klinik andere Gene auf Veränderungen hin zu analysieren, welche ebenfalls an der Regulation des Eisenstoffwechsels beteiligt sind In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels einer multizentrischen Fall-Kontroll-Studie bei einem Morbus Parkinson-Kollektiv (Morbus Parkinson: MP) und entsprechenden Kontrollkollektiv auf mögliche Zusammenhänge zwischen Veränderungen im HFE-Gen und dem idiopathischen MP hin untersucht. Bei der Entstehung des MP wird von einer multifaktoriell bedingten Pathogenese ausgegangen, wobei noch nicht abschließend geklärt ist, ob es sich dabei um eine Wechselwirkung zwischen verschiedenen genetischen Vulnerabilitätsfaktoren oder aber um einen additiven Effekt von genetischer Veranlagung und Umweltfaktoren handelt. Seit der Erkenntnis, dass bei MP-Patienten erhöhte Eisenwerte in der Substantia nigra vorliegen sowie vermehrt oxidativer Stress in diesem Gewebe nachweisbar ist, wird auch den Proteinen, welche den Eisenhaushalt regulieren, eine mögliche Bedeutung in der Pathogenese der MP-Erkrankung zugesprochen. Dabei scheint das HFE-Gen ein geeignetes Kandidatengen bei der Suche nach der Ätiologie dieses Krankheitsbildes zu sein. Bei der genetischen Untersuchung der vorliegenden Arbeit konnten 4 exonische missense-Mutationen und dieselbe intronische Sequenzvariation wie beim HH1-Kollektiv nachgewiesen werden. Die gefundenen H63D-Mutation und die C282Y-Mutation stellen dabei die zwei wichtigsten mit der HH1 assoziierten Mutationen dar. Die statistische Auswertung dieser Mutationen durch den Vergleich der beiden Kollektive ergab allerdings für diese zwei exonischen Mutationen und die intronische Sequenzvariation keine signifikante Assoziation mit dem MP. Die zwei anderen exonischen missense-Mutationen (T217I und K92N) wurden nur bei je einem MP-Patienten beobachtet und konnten im Kontroll-Kollektiv nicht nachgewiesen werden. Die K92N wird im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal beschrieben. Insgesamt ist durch die hier erhobenen Daten kein sicherer Zusammenhang zwischen Mutationen im HFE-Gen und dem idiopathischen MP zu erheben. Obwohl diese Ergebnisse demnach gegen einen Einfluss von Veränderungen im HFE-Gen in Bezug auf den MP sprechen, kann dies ohne weitere Untersuchungen hinsichtlich additiv wirksamer Faktoren nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden.

The HFE-gene associated hereditary hemochromatosis (HH1) is a monogenetically inherited disease, which is characterized by an excessive accumulation of iron caused by sequence variations in the HFE-gene with following lesions of diverse organic systems. The homocygous C282Y-mutation in exon 4, the homocygous H63D-mutation in exon 2 and the compound-heterocygosity of these two mutations are the most important genotypes associated with this disease. These genotypes can be found in many individuals, but by far not in all the individuals with a corresponding phenotype. The routine molecular genetic analysis of the examined HH1-collective could prove only for a part of them a corresponding genotype, too. Hence, all 6 exons of the HFE-Gene were examined by DHPLC and genetic sequencing. In this case, the incidence of the two major mutations of the HH1 as exonic missense-mutations and an intronic sequence variation (IVS2/3889*T>C) could be proven, over which the significance has yet to be determined. Besides, a linkage of the H63D-mutation with this intronic sequence variation could be found by an analysis of the family tree. In addition to the genetic examination, the actual clinical symptoms of each patient were collected by a questionnaire. Thus comparisons between the present genotype and phenotype could be drawn. For this, the patients with three of the most important genotypes were divided into three groups and their test results of the iron regulating parameter, representing the occurrence and the severity of the iron overload, were compared among themselves. The highest test results were received for the homocygous C282Y-mutation, which was already to be expected following other studies. So a correlation between the underlying genotype and the severity of the iron overload could be borne out in the chosen collective once more. With regard to the genetic examination, it can be said that the examination of the two major mutations seems to be sufficient when HH1 is suspected, because the presence of other mutations in the HFE-gene can be expected only in a negligible part of the patients. It seems more practical to analyse other genes, which also have a stake in the iron regulation, in patients with negative tests in the HFE-gene but a typical clinic. In the second part of this study there was made a multi-centric case-control-study in a Parkinson’s disease collective (PD) and a corresponding control group to examine possible correlations between the variations in the HFE-gene and the idiopathic PD. A multifactorially conditioned pathogenesis is expected in the emergence of the PD, but it is not yet finally clarified, if there is an interaction between various genetic vulnerability factors or if there is an additive effect of genetic origin and environmental factors. Since the insight of an increased level of iron in the substantia nigra as well as an increased oxidative stress in this tissue, a potential importance of the proteins is assigned, which take part in the iron regulation, in the pathogenesis of the PD. Here, the HFE-gene seems to be a suitable candidate gene when looking for the aetiology of this disease. In the genetic examination of the present study, 4 exon missense-mutations and the same intronic sequence variation as seen in the HH1-collective could be proven. The proven H63D-mutations and the C282Y-mutations are the two most important mutations associated with the HH1. However, the statistic analysis of these mutations by comparing the two collectives revealed no significant association between these two exon mutations and the intronic sequence variation. The two other exon missense-mutations (T217I and K92N) were only proven in one patient with PD und could not be found in the control-collective. The K92N mutation is described for the first time within the context of the present study. In summary, a correlation between the mutations of the HFE-gene and the idiopathic PD cannot be by the available facts. Although these results are against an influence of the variations in the HFE-gene corresponding to the PD, this can not be ruled out with absolute reliability without further investigations with regard to additionally influencing factors.