The proliferative and apoptopic in vitro effects of progesterone and seven synthetic progestogens on normal and malignant human breast epithelial cells

Abstract

Objectives: The proliferative and apoptopic effects of eight pharmacologically diverse progestogens, currently used in or under investigation for use in HRT preparations were investigated in growth-factor and /or estradiol treated normal breast epithelial MCF10A cells and estrogen receptor positive HCC1500 primary breast cancer cells, and various markers of apoptosis were determined. The progestogens used were natural progesterone (P), and the synthetic progestogens chlormadinone acetate (CMA), medroxyprogesterone acetate (MPA), norethisterone (NET), levonorgestrel (LNG), dienogest (DNG), gestodene (GSD), and the desogestrel metabolite 3-ketodesogestrel (KDG).

Methods: MCF10A (human epithelial, estrogen- and progesterone-receptor negative normal breast cells) were incubated with each of the progestogens in turn at concentrations ranging from 10-6M to 10-10M in the presence of the growth factors (GFs) EGF, FGF and IGF-I at 10-12M. HCC1500 (human estrogen- and progesterone-receptor positive primary breast cancer cells) were incubated in the same way in the presence of GFs and/or estradiol (E2) at 10-10M. Cell proliferation rate was measured by the ATP-assay and cell death by photometric enzyme immunoassay. Cell proliferation and ratios of cell death : proliferation were calculated from these results. Further proliferation assays were carried out in the presence of the proliferation inhibitors PD98059 and LY294002, and also with 4-hydroxytamoxifen and letrozole. ELISAs were used to measure the markers of apoptosis cytochrome C, sFasL and p53 released from the cells in the presence of the progestogens and GFs and/or E2.

Results: A marked diversity was seen among the progestogens. C-21 progesterone derived MPA and CMA further stimulated the proliferation of growth factor-treated normal MCF10A breast cells, and had an opposite inhibitory effect on growth factor- and/or E2-treated HCC1500 cells. C-19 testosterone derived NET, LNG, DNG, GSD and KDG had no effect on growth factor-treated MCF10A cells, proliferative effects on HCC1500 cells in the presence of growth factors, inhibitory or neutral effects in the presence of E2 and, most relevant to the in vivo situation, inhibitory or neutral effects in the presence of growth factors and E2. The proliferative effects of the C-19 testosterone derivatives NET, LNG, DNG, GSD and KDG on HCC1500 cells in the presence of growth factors were all inhibited by the estrogen receptor antagonist 4-hydroxytamoxifen, suggesting that the proliferative effects of these synthetic progestogens may involve stimulation of the estrogen receptor. Differences were also demonstrated in the involvement of mitogen activated protein kinase (MAPK) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in the proliferative pathways, and the release of the markers of apoptosis, cytochrome C, sFasL and p53.

Conclusion: Estrogens and mitogenic growth factors from stromal breast tissue are significant in the growth-regulation of breast cells and may alter responses to progestogens. Despite the experimental limitations described in this work, the results indicate that certain different progestogens are able to induce proliferation of or inhibit the growth of benign or malignant human breast epithelial cells independently of the effects of growth factors and E2, and therefore the choice of progestogen for hormone therapy may be important in terms of influencing a possible breast cancer risk.

Zielsetzung: Der proliferative und apoptotische Effekt von acht pharmakologisch unterschiedlichen Gestagenen, die bereits zur HRT angewandt oder hierfür überprüft werden, wurden in normalen mit Wachstumsfaktor und / oder Estradiol behandelten MCF10A Brustdrüsenzellen und Östrogenrezeptor positiven HCC1500 Zellen primärer Mammakarzinome untersucht. Verschiedene Apoptosemarker wurden bestimmt. Folgende Gestagene wurden benutzt: natürliches Progesteron (P), sowie die synthetischen Gestagene Chlormadinonacetat (CMA), Medroxyprogesteronacetat (MPA), Norethisteron (NET), Levonorgestrel (LNG), Dienogest (DNG), Gestoden (GSD) und der Desogestrel- Metabolit 3-Ketodesogestrel (KDG).

Methodik: MCF10A (humane epitheliale, Östrogen- und Progesteronrezeptor negative normale Brustdrüsenzellen) wurden mit den jeweiligen Gestagenen in Konzentrationen von 10-6M bis 10-10M und Zugabe der Wachstumsfaktoren (GFs) EGF, FGF and IGF-I zu 10-12 M inkubiert. HCC1500 (humane Östrogen- and Progesteron-Rezeptor positive primäre Brustkrebszellen) wurden in gleicher Weise unter Zugabe von GFs und/oder Estradiol (E2) zu 10-10M inkubiert. Die Zellproliferationsrate wurde durch ATP-Assay und der Zelltod durch photometrischen Enzym-Immunoassay bestimmt. Die Zellproliferation und das Verhältnis von Zelltod zu Proliferation wurden aus diesen Ergebnissen berechnet. Weitere Proliferations-Assays wurden unter Zugabe der Proliferationshemmer PD98059 und LY294002, sowie mit 4-Hydroxytamoxifen and Letrozol durchgeführt. Unter Anwendung von ELISAs wurden die Apoptosemarker Cytochrom C, sFasL und p53, die aus den Zellen in Anwesenheit der Gestagene, GFs und / oder E2 freigesetzt werden, gemessen.

Ergebnisse: Unter den Gestagenen sind deutliche Unterschiede zu beobachten. Die vom C-21 Progesteron abgeleiteten MPA and CMA stimulieren die Proliferation von mit GF behandelten normalen MCF10A Brustzellen, haben jedoch einen inhibitorischen Effekt auf mit GF und / oder E2 behandelte HCC1500 Zellen. Die C-19 Testosteronderivate NET, LNG, DNG, GSD und KDG zeigen keinen Effekt auf mit GF behandelte MCF10A Zellen, proliferative Effekte auf HCC1500 Zellen in Anwesenheit von GF, neutrale oder inhibitorische Effekte mit E2 und, als bedeutsamster Aspekt für die in vivo Situation, inhibitorische oder neutrale Effekte in Anwesenheit von GF und E2. Der proliferative Effekt der C-19 Testosteron-Derivate NET, LNG, DNG, GSD und KDG auf HCC1500 Zellen unter Anwesenheit von GF wurde jeweils durch den Östrogenrezeptor Antagonisten 4-Hydroxytamoxifen gehemmt. Dies lässt darauf schliessen, dass die proliferative Wirkung dieser synthetischen Gestagene mit der Stimulation des Östrogenrezeptors in Zusammenhang stehen könnte. Unterschiede zeigen sich ebenfalls in Zusammenhang mit der Mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK) und der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) in den proliferativen Pathways, sowie bei der Freisetzung der Apoptosemarker Cytochrom C, sFasL und p53.

Schlussfolgerung: Östrogene und mitogene Wachstumsfaktoren von stromalem Brustdrüsengewebe sind für die Wachstumsregulation von Brustzellen bedeutsam und können das Ansprechen auf unterschiedliche Gestagene verändern. Trotz der experimentellen Limitierung im in vitro-Modell, zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass verschiedene Gestagene proliferativ oder hemmend auf das Wachstum benigner oder maligner humaner Brustzellen wirken, und zwar unabhängig vom Einfluss von Wachstumsfaktoren und E2. Daher kann die Wahl des Gestagens in der Hormonersatztherapie für ein mögliches Brustkrebsrisiko von Bedeutung sein.