Untersuchung apoptotischer Signaltransduktionswege in kernlosen humanen Blutzellen

Abstract

Apoptose ist ein zelluläres Selbstmordprogramm, das– ausgelöst durch verschiedene Stimuli– über hauptsächlich zwei unterschiedliche Signalwege zu einer kettenreaktionsähnlichen Aktivierung spezialisierter Cysteinproteasen (Caspasen) und schließlich zur kontrollierten Desintegration und Eliminierung der Zelle führt, welches mit einem morphologisch typischem Bild einhergeht. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob in kernlosen menschlichen Blutzellen wie Erythrozyten und Thrombozyten, die im Zuge ihrer Reifung aus Vorläuferzellen den Großteil ihrer Organellen verlieren, noch Teile des apoptotischen Apparates vorhanden sind und aktiviert werden können. Reife Erythrozyten enthalten nicht zu vernachlässigende Mengen an Caspase 3 und –8, während essentielle Bestandteile des mitochondrialen Signalwegs der Apoptose wie Caspase 9, Apaf 1 und Zytrochrom c vollständig fehlen. Erstaunlicherweise ließen sich die erythrozytären Caspasen, die sich in vitro als prinzipiell funktionsfähig erwiesen, in intakten Erythrozyten weder durch lange Lagerung noch durch verschiedene proapoptotische Stimuli aktivieren. Bei Erhöhung des zytosolischen Calciums wurden in Erythrozyten nicht Caspasen, sondern die Cysteinprotease Calpain aktiviert. Diese führte zur Spaltung von Fodrin (Spectrin) und morphologischen Veränderungen wie Zellschrumpfung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Erythrozyten über keinen funktionellen apoptotischen Apparat mehr verfügen. Die im Rahmen ihrer Alterung zu beobachtenden morphologischen Veränderungen scheinen vielmehr auf die Calcium-abhängige Aktivierung der Protease Calpain zurückzuführen zu sein. Obwohl Thrombozyten alle Elemente des mitochondrialen Signalweges der Apoptose enthalten, ließ sich mit den meisten bekannten proapoptotischen keine Caspaseaktivierung erzielen. Mit Tributylzinn (TBT) gelang es zum ersten Mal, eine Substanz zu finden, mit der sich Caspase 9 und Caspase 3 in Thrombozyten aktivieren lassen. Interessanterweise führte Tributylzinn (TBT) in Thrombozyten zu einer deutlich schnelleren Aktivierung von Caspase 9 als in kernhaltigen Jurkat T Zellen. Zusätzlich konnte mittels Gelfiltrationsanalysen gezeigt werden, dass diese Aktivierung von Caspase 9 ohne die Bildung eines Apoptosoms erfolgt. Diese Beobachtungen lassen sich mit Daten vereinbaren, die einen vom Mitochondrium unabhängigen Mechanismus der Apoptoseinduktion durch TBT in manchen Zellsystemen vermuten lassen (Nopp et al. 2002). Da die meisten proapoptotischen Stimuli in Thrombozyten zu keiner Caspaseaktivierung führen, sind die thrombozytären Caspasen anscheinend nicht über den bekannten mitochondrialen Signalweg aktivierbar, und Thrombozyten somit weder als Modellsystem zur weiteren Erforschung dieses Signalweges noch als Screeningsystem für neuartige Chemotherapeutika.

Although proteases of the caspase family are essential mediators of apoptosis in nucleated cells, in anucleate cells their presence and potential functions are almost completely unknown. Human erythrocytes are a major cellpopulation that does not contain a cell nucleus or other organelles. However, during senescence they undergo certain morphological alterations resembling apoptosis. In the present study, we found that mature erythrocytes contain considerable amounts of caspase-3 and -8, whereas essential components of the mitochondrial apoptotic cascade such as caspase-9, Apaf-1 and cytochrome c were missing. Strikingly, although caspases of erythrocytes were functionally active in vitro, they failed to become activated in intact erythrocytes either during prolonged storage or in response to various proapoptotic stimuli. Following an increase of cytosolic calcium, instead the cysteine protease calpain but not caspases became activated and mediated fodrin cleavage and other morphological alterations such as cell shrinkage. Our results therefore suggest that erythrocytes do not have a functional death system. In addition, because of the presence of procaspases and the absence of a cell nucleus and mitochondria erythrocytes may be an attractive system to dissect the role of certain apoptosis-regulatory pathways. Platelets represent enucleate cells that comprise all elements of the mitochondrial apoptosis pathway. Activation of caspases has been demonstrated to be involved in thrombocytopenia and prolonged storage of platelet concentrates. However, no apoptotic stimuli capable of activating the endogenous caspase cascade have been identified so far. Usingtributyl tin (TBT) we could identify a compound that is capable of activating caspase-9 and -3 in platelets. Recent studies implicate that TBT induces apoptosis via the mitochondrial signaling pathway that is characterized by the formation of a high-molecular-weight complex (apoptosome) containingthe adapter protein Apaf-1 and active caspase-9. Interestingly, addition of TBT induced the activation of caspase-9 in an ultra-rapid kinetic within the first 2 min. In addition, size exclusion chromatography revealed that TBT-mediated processing of caspase-9 occurs in the absence of the apoptosome. Thus, these data implicate that TBT induces the activation of caspase-9 by a mechanism not involving the formation of the apoptosome.