Bedeutung von Erythropoietin für Neuroprotektion und Neuroregeneration in läsionierten adulten Neuronen im ZNS

Abstract

Erythropoietin (EPO) ist als hämatopoietisches Zytokin insbesondere als Hormon der Erythropoese bekannt. In den letzten Jahren gewann es darüber hinaus an Bedeutung, als erkannt wurde, dass es auch anti-apoptotische und neuroprotektive Effekte im ZNS hat, und somit ein potentielles Therapeutikum für zahlreiche neurologische Erkrankungen darstellen könnte. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von EPO auf Zellüberleben und Neuritogenese adulter retinaler Ganglienzellen (RGZ) in einemGewebekulturmodell untersucht. Dabei wurde EPO entweder nach Quetschläsion des optischen Nervs (ON) in vitro oder aber in vivo intravitreal injiziert. Die Ergebnisse wurden anschliessend mit denen verglichen, die durch Applikation des neuroprotektiven Ad.Bcl-XL-Adenovirus erzielt werden konnten. Um die Wirkmechanismen von EPO zu verstehen, wurden die intrazellulären Signalübertragungskaskaden Jak/STAT-3, p44/42 MAP-Kinase, und PI3-Kinase/Akt näher untersucht. Des weiteren wurde die Hochregulierung nukleärer Zielgene, insbesondere des anti-apoptotischen Proto-Onkogenes Bcl-XL, dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass eine einzelne Applikation von EPO zu RGZ in Kultur, ebenso wie wiederholte Injektionen des Zytokines in vivo, sowohl die Anzahl als auch die Länge neu generierter Neuriten nach Nervenläsion steigert. Dabei erhöhten sich die Werte um das 2,5-fache (Anzahl) und 10-fache (Länge) im in vitro-Modell bzw. um das 2,16-fache (Anzahl) und 5,7-fache (Länge) im in vivo-Modell, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen nach Läsion. Im Gegensatz zu Bcl-XL, welches sich nur im in vivo-, nicht jedoch im in vitro-Modell als neuroprotektiv erwiesen hatte, zeigte EPO sowohl anti-apoptotische als auch neuroprotekive Effekte in beiden Modellen. Die Western-Blot-Versuchsreihen zur Untersuchung signalvermittelnder Kaskaden erbrachten Hinweise für eine EPO-vermittelte Bcl-XL-Induktion. Pharmakologische Inhibition von Jak-2/STAT-3 durch AG 490 hemmt EPO-induzierte Neuritenregeneration kultivierter RGZ. Zudem zeigte sich in Zytokin-behandelten Neuronen eine starke Hochregulierung von phosphoryliertem STAT-3; für STAT-1 und STAT-5 konnte kein derartiger Effekt festgestellt werden. Dies legt nahe, dass STAT-3-Induktion eine Rolle bei der EPO-induzierten Neuritogenese spielt. Ebenso scheinen die klassischen regenerationsvermittelnden PI3K- und MAPK-Signalkaskaden hierbei von Bedeutung zu sein. Eine Hochregulierung von phosphorylierter p44/42 MAPK nach EPO-Applikation sowie eine Hemmung der Neuritogenese nach PI3K-Inhibition konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass EPO das Überleben und Auswachsen von Neuriten von geschädigten adulter ZNS-Neuronen fördert, also Neuroprotektion und axonale Regeneration vermittelt, wenn es nach Läsion appliziert wird, und dass dieser Vorgang vermutlich über eine STAT-3-vermittelte Bcl-XL-Induktion aktiviert wird.

Erythropoietin (EPO) is a cytokine hormone commonly associated with its role as regulator of erythropoiesis. Over the last years, interest in EPO has increased after the discovery of its anti-apoptotic and neuroprotective effects in the CNS, making it a potential therapeutic agent for various neurological diseases. Here, we analysed the impact of EPO on neuritogenesis and cell survival in a cell culture model of adult retinal ganglion cells (RGCs), by postlesional in vitro conditioning following crush of the optic nerve, or by intravitreal application in vivo, and compared the results to those of the neuroprotective Ad.Bcl-XL-adenovirus, which has recently been suggested to stimulate regeneration (Kretz et al., 2004). To elucidate its mode of action, we focused on presumed intracellular downstream mechanisms of EPO; the Jak/STAT-3 pathway, the activation of p44/42 MAP-kinase, and the induction of PI3-kinase/Akt, and nuclear target gene up-regulation including the anti-apoptotic proto-oncogene Bcl-XL. We could demonstrate that a single application of EPO to cultured RGCs, or repeated EPO injections in vivo, in postlesional settings, increased both numbers and length of newly generated neurites 2.5-fold/n and 10-fold/l, for the in vitro setting, and 2,16-fold/n and 5,7-fold/l for the in vivo setting, respectively, compared to lesioned untreated controls. In contrast to Bcl-XL, which revealed neuroprotective function only in vivo, but not in vitro, EPO mediated sustained anti-apoptotic effects, thus promoting survival and neurite extention of cultured severed RGCs. Investigations of downstream signalling pathways suggest EPO-mediated Bcl-XL induction, as shown by western blot analysis. Pharmacological inhibition of Jak-2/STAT-3 caused a block of EPO-induced neurite regeneration in cultured RGCs. Accordingly, cytokine treated neurons strongly up-regulate phosphorylated STAT-3, while no effect was observed for STAT-1 and STAT-5, suggesting that STAT-3 induction contributes to EPO-related neuritogenesis. We also assayed the role of classical survival- and regeneration promoting cascades including PI3K and MAPK-pathways, respectively. Based on growth response and protein expression analyses, these well-known protective cascades seem also involved in EPO-mediated neuroregeneration, with phosphorylated p44/42 MAPK being up-regulated after cytokine application, and suppression of neurogenesis after inhibition of PI3-kinase. We have demonstrated that EPO holds an important potential for survival and regeneration of severly injured adult CNS neurons, when administered delayed after injury, possibly by STAT-3 dependent Bcl-XL induction. However, according to non-linear, but complex network interactions of transduction cascades, other signalling pathways, such as PI3-kinase and MAP-kinase-cascades, may also be involved.