Etablierung von home-made cDNA Microarrays und Untersuchung der Genexpression bei Posttraumatischer Belastungsstörung

Abstract

Die Posttraumatische Belastungsstörung (PTSD) könnte sich im Zuge einer Fehladaptation des Körpers zur Abwehr der akuten Stressantwort entwickeln. Aufgrund des sympatischen Hyperarousals in PTSD wurde schon früh angenommen, dass bei Patienten mit Posttraumatischen Belastungsstörungen das Immunsystem betroffen sein könnte. Mit selbst hergestellten cDNA Microarrays, die vornehmlich Gene aus Stressgeschehen, Inflammation sowie Apoptose enthielten, wurden in der vorliegenden Arbeit Auswirkungen von PTSD auf Genexpressionsebene untersucht. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen, um sämtliche Bedingungen, die die Messungen beeinträchtigen könnten, zu standardisieren. Besonders erwähnenswert ist, dass es sich beim untersuchten Patientenkollektiv um eine homogene Gruppe handelt, da alle Probanden das selbe traumatische Erlebnis hatten (Flugkatatstrophe von Ramstein, 1989). Trotz des langen Zeitintervalls zwischen traumatischem Erlebnis und dieser Studie zeigten sämtliche Probanden immer noch typische Auffälligkeiten bei den diagnostischen Interviews, sowie typische psychosomatische Symptome. Das Studienkollektiv umfasste acht Patienten und acht Kontrollpersonen. Des weiteren wurde großer Aufwand betrieben, um die Microarray Versuche unter bestmöglichen standardisierten Bedingungen durchzuführen. Nach Normalisierung der Daten wurden drei statistische Methoden angewendet, der gepaarte t-Test, der Wilcoxon-Test und die Rank Produkt Methode. Letztlich wurden vier hoch- und 14 vermindert exprimierte Gene gefunden, die für mindestens eine dieser statistischen Methoden Signifikanz erreichten. In dieser Studie wurde der Fokus auf die vermindert regulierten Gene gerichtet. Sieben dieser Gene und ein zusätzliches Gen, der xc(-)Glutamat-Cystin Antiporter wurden aufgrund ihres möglichen physiologischen Zusammenhangs ausgewählt, und ihre Regulation durch quantitative Real Time PCR nachgewiesen. Die Ergebnisse der Real Time PCR bestätigten die Microarray Versuche bis auf zwei Gene, 3-PHGDH und EDG4. Die meisten vermindert exprimierten Gene sind mit Immunfunktionen oder reaktiven Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species, ROS) assoziiert. Die selenabhängigen Enzyme Superoxid dismutase (SOD), Thioredoxin reduktase (TXR) sowie der xc(-) Transporter lassen sich in einen physiologischen Zusammenhang bringen. Es ist lange bekannt, dass SOD das O2- Radikal zu H2O2 reduziert. Aufgrund der verminderten Genexpression von SOD könnte kurzzeitig eine reduzierte Präsenz von antioxidativen Enzymen wie SOD und TXR (und reduziertem Enzymprotein) könnte es zu einer reaktiven Anhäufung von OH-Radikalen kommen, die nicht ausreichend kompensiert werden kann. Demzufolge könnte eine ROS Akkumulation ein Grund für das höhere Risiko von PTSD-Patienten sein, Autoimmunerkrankungen oder kardiovaskulären Krankheiten zu entwickeln. Glutathion (GSH) ist der wichtigste antioxidative intrazelluläre Puffer. Die in dieser Studie gezeigte verminderte Expression des Chlorid-abhängigen xc(-)Transporters, dessen Funktion die Glutathion-Synthese limitiert, könnte die Glutathion Erneuerung durch reduzierte Cystin-Aufnahme beeinflussen. Dieser Transporter spielt desweiteren eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der extrazellulären Glutamatkonzentration im Gehirn, die mit der Rückfallgefahr bei Drogenkonsum assoziiert ist. Dies könnte ein Ansatz für eine pharmakologische Therapie mit N-acetyl Cystine (NAC), einem xc(-)Agonisten darstellen, die im Tierversuch erfolgreich eingesetzt wurde. Eine Behandlung von PTSD Patienten mit NAC könnte zu einer Verminderung der Stress-assoziierten Symptome führen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Microarray Technologie auch bei lange zurückliegenden Traumata Änderungen der mRNA Genexpression detektieren kann. Die Ergebnisse dieser Studie können als Ausgangspunkt für Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkungen auf Proteinebene dienen. Sollten Veränderungen der Zielmoleküle auf dieser Ebene bestätigt werden, würden sich neue pharmakologische Therapieansätze für eine Erkrankung ergeben, deren Symptomatik bisher nur unzureichend behandelbar ist.

Posttraumatic stress disorder (PTSD) may develop as a failure of the body to reverse the acute stress response. The main three characteristic clusters of symptoms of posttraumatic stress disorder (PTSD) are: (I) sustained reexperiencing of stressors, (II) persistent avoidance of event reminders and “numbing” of general responsiveness, and (III) sustained sympathetic hyper arousal. It has been known for a long time, that stress affects immune functions. Therefore stress related disorders should be accompanied by alterations of immune parameters. Because of the constant stress of the sympathetic hyper arousal state in PTSD, immune functioning has early been hypothesized to be altered. Posttraumatic stress disorder has been investigated on the transcriptional level in a group of patients having experienced the same traumatic episode (Ramstein, 1988). Expression profiling experiments, using custom-made DNA microarrays focused on inflammation, apoptosis, stress response and related pathways revealed a number of up- and downregulated transcripts in the patients. The production and the establishing of microarrays are described in detail in Material and Methods of this dissertation. Attempts to reconcile the majority of downregulated transcripts with close physiological interactions of the gene products revealed a strong assembly of proteins in relation to reactive oxygen species (ROS), such as thioredoxin reductase, superoxide dismutase, and the xc(-) glutamate-cystine antiporter. This outcome has led to a new hypothesis on differential gene regulation in PTSD. Hence, broader screening of transcripts by microarray technology may provide better clues as to which target molecules are good candidates in the disease.