Bestimmung optimaler Parameter und Reaktionsbedingungen für die Beschichtung von Schwingquarzen zur Messung einer blutgruppenspezifischen Ankopplung von Erythrozyten

Abstract

Die Verwendung von Schwingquarzen als Biosensoren in der Immunhämatologie, insbesondere in der Blutgruppenanalytik, stellt eine neue, zuverlässige und zugleich auch kostengünstige Methode dar. Die Schwierigkeiten bei der Verwendung bestehen darin, dass es sich bei der sensitiven Schicht des Schwingquarzes um biologisches Material handelt, das auf einer künstlichen Oberfläche angekoppelt werden muss, ohne dass dies Folgen für seine biologische Aktivität haben darf. Die Arbeit befaßt sich im Schwerpunkt mit der Optimierung und Weiterentwicklung der sensitiven Beschichtung eines Schwingquarzes zur blutgruppenspezifischen Ankopplung von Erythrozyten und der Verbesserung der Parameter und Reaktionsbedingungen für die spezifische Ankopplung dieser. Zudem wird gezeigt, welche weiteren serologischen Fragestellungen mit dieser Art von Messverfahren noch beantwortet werden kann. Die sensitive Beschichtung des Quarzes setzt sich aus einer Protein A Schicht, gebunden auf der Goldelektrode des Quarzes und den jeweiligen blutgruppenspezifischen Antikörper zusammen. Dabei sollen aus Kosten- und Zeitgründen möglichst Materialien (wie Antikörper, Lösungs- und Trägermittel) aus der bisherigen serologischen Routinediagnostik verwendet werden. Für diese Untersuchungen ist es erforderlich, dass variierte Beschichtungstechniken und neu entwickelte Schichtarchitekturen, schnell und ohne großen Aufwand getestet werden können. Eine bereits sich in der Routineerprobung befindende automatisierte Schwingquarzanlage ist für diese Tests zwar einsetzbar, aber auf Grund ihres Aufbaus und ihrer Komponenten komplex. Es wurde deshalb ein System entwickelt, aufgebaut und eingesetzt, das nur aus den für diese Fragestellung notwendigen Komponenten besteht, ein so genanntes Dummy-System. Das Dummy–System setzt sich aus der Messzelle mit angeschlossener Fluidik zusammen, auf die aufwendige Elektronik der „schwingenden“ Anlage wird verzichtet. Die Auswertung erfolgt optisch über ein Auflichtmikroskop und eine Auswertungssoftware.

Die Umsetzung der Beschichtungs- und Messprotokolle des schwingenden Systems (ein IgG-Monolayer auf einer Protein A Schicht) in die Dummy-Anlage funktioniert ohne Probleme. Die Auswertung der Ergebnisse über die Auszählung der gebundenen Erythrozyten mit dem Auflichtmikroskop und der Auswertungssoftware funktioniert mit hoher Sensitivität und Spezifität. Weiterhin wird die hohe Sensibilität der Oberfläche dargestellt. Eine Verdünnung der Blutprobe auf bis zu 1 : 100 000 kann durch den Quarz detektiert werden. Die Beschichtung zeigt damit eine höhere Sensibilität, als herkömmliche automatisierte Methoden in der Blutgruppenbestimmung (z. B. ID-Micro-Typing-System der Firma DiaMed). Der zweite Teil der Versuche zeigt, welche weiteren Möglichkeiten der Schichtarchitektur im Dummy-System aufgebaut und getestet werden können. Ein weiteres Ziel der Arbeit ist der direkte Antikörpernachweis. Es werden erfolgreich mit Antikörpern beladene Erythrozyten spezifisch auf der Quarzoberfläche gebunden. Dabei wird eine Beschichtung aus Protein A und einem Anti-Ig-Immunglobulin verwendet. Die Regeneration gebrauchter Quarze im Dummy-System stellt eine weitere Aufgabe der Arbeit dar. Es wird mit chemischen und mechanischen Methoden versucht, die Oberfläche von spezifisch gebundenen Erythrozyten zu säubern. Hierbei zeigt sich, dass im nicht schwingenden System noch keine zufrieden stellende Lösung der Regeneration gefunden werden kann.

Utilization of QCM as biosensors in the field of immune haematology especially for blood typing is a new reliable and cost-effective method. Difficulties using this method are that the sensitive quartz layers consist of biological material that should be coupled on an artificial surface without effecting the biological activity of the layer.

The main focus of the presented work is the optimisation and the further development of sensitive QCM coating layers for the blood group specific coupling of erythrocytes and the enhancement of coupling parameters and reaction conditions. Furthermore the serological questions that could be answered with this method are mentioned. The sensitive layer is made up of a protein A layer and on it immobilised blood group specific antibodies. Antibodies and other biological material should be materials that are used in the routine serological diagnostics considering time efficiency and reasons of economy.