Wirkung des von Vibrio parahaemolyticus produzierten Hämolysin Kanagawa (TDH) auf menschliche Erythrozyten

Abstract

Das Hämolysin Kanagawa, oder auch thermostable direct hemolysin (TDH), produziert von Vibrio parahaemolyticus, war bislang als Auslöser für Hämolyse bei menschlichen Erythrozyten bekannt. Flussstudien zeigten, dass es einen Kationkanal induziert. Inhalt dieser Arbeit ist zum Einen die genaue Entschlüsselung der Kanaleigenschaften mittels des patch-clamp Verfahrens, zum Anderen die Klärung der funktionellen Bedeutung dieses Kationkanals und der durch diesen induzierten Ionenflüsse unter Zuhilfenahme der Durchflusszytometrie oder auch fluorescence activated cell sorting (FACS). Inkubation der Erythrozyten mit 1 U/ml des Hämolysins führt bereits nach wenigen Minuten zu einer unselektiven Kationpermeabilität der Membran. Darüber hinaus aktiviert das Hämolysin durch Clotrimazol hemmbare K+-Kanäle, was auf eine Aktivierung des Ca2+-abhängigen Gardos-Kanals hindeutet. Innerhalb von 5 min führen 1 U/ml des Hämolysins bereits zu mäßiger Zellschrumpfung, die in kalziumfreiem Medium aufgehoben ist. Erythrozyten, die mit 0,1 U/ml des Hämolysins behandelt werden, erfahren innerhalb von 60 min keine signifikante Hämolyse. Wird das extrazelluläre Na+ durch NMDG+ ersetzt, so führt dies zu einer leichten Zellschrumpfung, die durch Zusatz von 0,1 U/ml Hämolysin vervielfacht wird. Wie aus der Rate der Annexin-positiven Zellen ersichtlich wird, bewirkt eine 30minütige Inkubation mit 0,1 U/ml Hämolysin einen Verlust der Phosphatidylserinasymmetrie der Zellmembran, was als typische Begleiterscheinung apoptotischer Zellen gewertet werden kann. Sowohl die Erhöhung der extrazellulären K+-Konzentration, als auch die Zugabe des spezifischen Gardos-Kanal-Blockers Clotrimazol verringert signifikant die Rate der Annexin-bindenden Zellen. Zusammenfassend lässt dies darauf schließen, dass das Hämolysin Kanagawa eine Kationpermeabilität induziert und endogene Gardos-Kanäle aktiviert. Als Konsequenz davon kommt es zum Verlust der Phosphatidylserinasymmetrie, die zumindest teilweise auf den K+-Ausstrom durch den Gardos-Kanal zurückzuführen ist.

Hemolysin Kanagawa, a toxin from vibrio parahemolyticus, is known to trigger hemolysis. Flux studies indicated that hemolysin forms a cation channel. In the present study channel properties were elucidated by patch clamp and functional significance of ion fluxes by FACS analysis. Treatment of human erythrocytes with 1 U/ml hemolysin within minutes induces an unselective cation permeability. Moreover, hemolysin activates clotrimazol sensitive potassium channels, pointing to stimulation of calcium sensitive Gardos channel. Erythrocytes treated with hemolysin (0,1 U/ml) do not undergo significant hemolysis within the first 60 min. Instead hemolysin leads within 5 min to slight cell shrinkage which is reversed in calcium free saline. Replacement of extracellular natrium with NMDG leads to slight cell shrinkage which is potentiated by 0,1 U/ml hemolysin. According to annexin binding treatment of erythrocytes with 0,1 U/ml hemolysin leads within 30 min to breakdown of phosphatidylserin asymmetry of the membrane, a typical feature of erythrocyte apoptosis. The annexin binding is significantly blunted at increased extracellular potassium concentrations and by potassium channel blocker clotrimazol. In conclusion, hemolysin Kanagawa induces a kation permeability and activates endogeneous Gardos potassium channels. Consequences include breakdown of phosphatidylserin asymmetry which at least partially depends on cellular loss of potassium.