In-vivo und in-vitro Untersuchungen zur Rolle aktivierter Proteinkinase C in der Mb-Bipolarzellterminale der Goldfischnetzhaut

Abstract

1. Der alpha PKC Antikörper markiert Mb-Bipolarzellen. Darüberhinaus ist noch eine Population der ON-Zapfenbipolarzellen PKC-ir markiert. Die PKC-IR zeigt in den Mb-BCTs eine adaptationsabhängige Verteilung, wobei im helladaptierten Präparat die PKC-IR homogen durch die Mb-Terminale verteilt ist, im dunkeladaptierten Präparat ist die PKC-IR u.a. charakteristisch an der Membran der Terminale lokalisiert.

2. Der alpha pPKC Antikörper (Ser657) ist gegen „aktivierte“ PKC alpha gerichtet. Die Mb-Terminalen sind pPKC-ir. Helladaptierte Mb-Terminalen zeigen eine eher im Zytosol lokalisierte pPKC-IR, wohingegen im dunkeladaptierten Netzhautpräparat die pPKC-IR deutlich membranständig ist. Diese Translokation aktivierter PKC läßt sich mit Western Blot Untersuchungen nach differentieller Ultrazentrifugation bestätigen.

3. Mit Hilfe von geeigneten Primern konnte mit RT-PCR in Goldfisch- und Zebrafischnetzhautpräparaten PKC alpha und beta Aktin nachgewiesen werden. In der Goldfischnetzhaut zeigt sich, daß die Anzahl der alpha PKC mRNA Transkripte adaptationsabhängig variiert. Im Hellen liegen deutlich vermehrt PKC alpha Transkripte vor. Beta Aktin zeigt keine adaptationsabhängige Dynamik.

4. Sowohl PKC-IR als auch die pPKC zeigt eine geringe, wenngleich signifikant unterschiedliche Verteilung in der proximalen und distalen Mb-Terminale. Dies ist ein weiterer Hinweis auf die funktionelle Heterogenität der Mb-Bipolarzellterminale.

5. In-vitro Untersuchungen mit dem alpha PKC spezifischen Inhibitor Goe6976 zeigen, daß PKC alpha für die Endozytose nicht essentiell ist, sondern modulierend auf die Vesikeldynamik wirkt.

Introduction: Protein kinase C (PKC) is a signalling enzyme critically involved in many aspects of synaptic plasticity. In cyprinid retinae, the PKC alpha isoform is localized in a subpopulation of depolarizing bipolar cells that show adaptation-related morphological changes of their axon terminals. Material and Methods: We have studied the subcellular localization of phosphorylated PKC alpha (pPKC alpha) in cyprinid retinae under various conditions by immunohistochemistry with a phosphospecific antibody and a isoform-specific PKC blocker Goe6976. Moreover we used the activity-staining dye FM1-43 in combination with Goe6976 to investigate the role of PKC in vesicle dynamics. Results: In dark-adapted retinae, pPKC alpha immunoreactivity is weak in the cytoplasm of synaptic terminals, labelling being predominantly associated with the membrane compartment. In light-adapted cells, immunoreactivity is diffusely distributed throughout the terminal. Western blot analysis has revealed a reduction of pPKC alpha immunoreactivity in cytosolic fractions of homogenized dark-adapted retinae compared with light-adapted retinae. Pharmacological experiments with the isoform-specific PKC blocker Goe6976 have shown that inhibition of the enzyme influences immunolabelling for pPKC alpha, mimicking the effects of light on the subcellular distribution of immunoreactivity. Activity staining using the dye FM1-43 revealed that PKC alpha inhibition with Goe6976 affects FM1-43 staining under conditions of reduced activity but the blocker has no effect on dye accumulation during potassium induced depolarisation of bipolar cell terminals.

Conclusions: Our findings suggest that the state of adaptation modifies the subcellular localization of a signalling molecule (PKC alpha) at the ribbon-type synaptic complex. We propose that changes in the subcellular distribution of PKC alpha immunoreactivity might be one component regulating the strength of the signal transfer of the bipolar cell terminal.